多克隆位点

DNA重组（DNArecombination）技术：DNA重组的载体

-1

载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载

工具。常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。目前已

构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，

亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。

载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力

或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供

外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量

不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重

组操作。④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选

标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。⑤配备与宿主相适应

的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。

一、质粒载体

质粒是细菌染色体以外具有自主复制能力的小型双链环状DNA分子。在大肠杆菌中，

常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等。鉴于天然质粒

作为克隆载体存在着不同程度的局限性，各实验室便对其进行修饰改造，并逐步完

善。依复制是否受宿主细胞蛋白质合成控制分紧密型质粒（stringentplasmid）

和松驰型质粒（relaxedplasmid）。质粒载体大多是在天然松驰型质粒的基础上

经人工改造拼接而成。这类质粒在宿主蛋白质合成及染色体复制停止后尚能继续复

制至上千个拷贝。利用这一原理，在质粒扩增时，通过加入氯霉素抑制大肠杆菌蛋

白质合成，达到进一步扩增质粒的目的。

一种用作克隆载体的理想质粒一般具备下述特点：①具有松驰型复制子（如ColE

1），复制子（replicon）是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，并可协助维持

使每个细胞含有一定数量的质粒拷贝。②在复制子外存在几个单一的酶切位点（或

多克隆位点），以便目的DNA片段插入。③具有插入失活的筛选标记，理想的质粒

载体应具有两种抗菌素抗性标志，如氨苄青霉素抗性基因（Ampr）和四环素抗性基

因（Tetr）等，以便从平板中直接筛选阳性重组子。④分子量相对较小和较高的拷

贝数。此外，质粒的缺点是容量较小，一般只能接受小于15kb的外来DNA，插入片

段过大会导致重组子扩增速度减慢，甚至使插入片段失活。

下面介绍几种有代表性的质粒载体。

㈠pBR332质粒载体

pBR332质粒就是按这种设想构建的一种大肠杆菌质粒载体。pBR332是最早被广泛应

用于分子克隆的载体之一，至今尚在使用。pBR332的结构如图7-1所示，是研究得

最清楚的质粒，为一个4.36kb的环状双链DNA。pBR332由三个不同来源的部分组成：

①来源于ColE1的派生质粒pMB1的复制起始位点（ori）；②来源于pSF2124质粒易

位子Tn3的Ampr；③来源于pSC101质粒的Tetr。

pBR332质粒载体具有下述特点：

1．带有一个复制起始位点保证该质粒能在大肠杆菌中复制。

2．具有二个抗生素抗性基因（Ampr和Tetr）作选择标记和数个单一的限制性酶切

位点其中三个单一的酶切位点BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ均在Tetr基因内，PstⅠ识

别位点在Ampr基因内。当外源基因插入这些抗性位点时，就分别成为Amp敏感（Amp

s）或Tet敏感（Tets），即插入失活。

3．具有较小的分子量pBR332质粒载体的这种小分子量特征，不仅易于自身DNA的

纯化，而且能有效地克隆6kb大小的外源DNA片段。

4．具有较高的拷贝数而且经氯霉素扩增后，每个细胞可累积1000~3000个拷贝，

这为重组DNA的制备提供了极大的方便。

图7-1pBR332质粒结构示意图

㈡pUC质粒载体系列

pUC质粒是在pBR332基础上改建而成的。它们保留了pBR332的一部分，组入了一个

来自M13噬菌体在其5′-端带有一段多克隆位点的LacZ′基因，而发展成为具有双

重检测特征的新型质粒载体系列。一个典型的pUC系列的质粒载体包含如下4个组成

部分：①来自pBR332质粒的复制起始位点（ori）；②Ampr基因，但其DNA序列已

不再含有原来的核酸内切酶单一识别位点；③大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（LacZ）

的启动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构称为LacZ′基因；④位于LacZ′基因

中靠近5′-端的一段多克隆位点区段，但并未破坏该基因的功能。

pUC系列的多克隆位点一一对应于M13mp系列。PUC系列大多数是成对的，如pUC8/pU

C9、pUC18/pUC19，即每对间含有大致相同的多克隆位点（个别切口又可不同），

但整个多克隆位点反向倒装（故称其为一对）。不同对的pUC系列质粒载体的多克

隆位点的数目和种类不同。

与pBR332质粒载体相比，pUC系列具有许多方面的优越性，是目前基因工程研究中

最通用的大肠杆菌克隆载体之一。其优点有：①具有更小的分子量和更高的拷贝数，

在构建pUC系列时仅保留了pBR332的复制子和Ampr；②适应于组织化学筛选重组体，

pUC质粒结构中具有来自大肠杆菌LacZ操纵子的LacZ′基因，其编码的α-肽链可参

与α-互补作用。目的基因插入后，破坏LacZ基因的完整性。在重组实验中，可用

异丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTC）诱导LacZ基因表达β-半乳糖苷酶(β-galactosi

da)，该酶能消化5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖（X-gal）产生蓝色产物。

若LacZ基因插入失活，则缺乏β-半乳糖苷酶表达，也就不能消化X-gal，菌落为白

色即阳性重组体克隆，此称作蓝白斑实验；③pUC系列的多克隆位点与M13mp系列对

应，因此克隆的外源DNA片段就可以在二类载体系列之间来回“穿梭”，这使克隆

序列的测序极为方便。