密度梯度离心法

密度离心法是样品在一定惰性梯度介质中进行离心沉淀或沉降平衡，在一定离心

力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。该法的优

点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，既能分离具有沉淀

系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；③颗粒不会积压变形，能保持

颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。缺点：

①离心时间较长；②需要制备梯

度；③操作严格，不宜掌握。

等密度离心法

1．原理

等密度离心法是在离心前预先配制介质的密度梯度，此种密度梯度液包含了被分离样品中所

有粒子的密度，待分离的样品铺在梯度液或和梯度液先混合，离心开始后，当梯度液由于离

心力的作用逐渐形成底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀粒子也发生重新分

布。当管底介质的密度大于粒子的密度，粒子上浮；在弯顶处粒子密度大于介质密度时，则

粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即粒子密度等于介质密变，此时dr／dt

为零粒子不再移动，粒子形成纯组分的区带，与样品粒子的密度有关，而与粒子的大小和其

他参数无关，因此只要转速、温度不变，则延长离心时间也不能改变这些粒子的成带位置。

2．注意点：

①离心时间要长

②可用角式转头或水平式转头

③粒子密度相近或相等时不宜用

④密度梯度溶液中要包含所有粒子密度

⑤不能用刹车

四、梯度溶液的制备

(一)梯度材料的选择原则：

1．与被分离的生物材料不发生反应，且易与所分离的生物材料分开。

2．可达到要求的密度范围，且在所要求的密度范围内，粘度低，渗透压低，离子强度和pH

变化较小。

3．不会对离心设备发生腐蚀作用。

4．容易纯化，价格便宜或容易回收。

5．浓度便于测定，如具有折光率。

6．对于分析超迷离心工作来说，它的物理性质，热力学性质应该是己知的。

(二)梯度材料的应用范围下面简单介绍几种常用的密度梯度材料的性质及其应用范围。

1．蔗糖：水溶性大，性质稳定，渗透压较高，其最高密度可达1．33g/ml，且由于价格低，

容易制备，是现在实验室里常用于细胞器、病毒、RNA分离的梯度材料，但由于有较大的渗

透压，不宜用于细胞的分离。

2．聚蔗糖：商品名Ficoll，常采用Ficoll—400也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压

低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。主要用于分离各种细胞

包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。

3．氯化铯：是一种离于性介质、水溶性大，最高密度可达1.91g／nd。由于它是重金属盐类，

在离心时形成的梯度有较好的分辨率，被广泛地用于DNA、质粒、病毒和脂蛋白的分离，

但价格较贵。

4．卤化盐类：KBr和NaCI可用于脂蛋白分离，KI和NaI可用于RNA分离，其分辨率高于铯

盐。NaCl梯度也可用于分离脂蛋白，NaI梯度可分离天然或变性的DNA。

5．Percoll:是商品名，它是一种SiO2胶体外面包了一层聚乙烯吡咯酮(PVP)，渗透压低，它

对生物材料的影响小，而且颗粒稳定，在冷却和冻融情况下还是稳定的。其粘度高，在酸性

pH和高离子强度下不稳定。它可用于细胞、细胞器和病毒的分离。

分离外周血中的单个核细胞（PBMC）

1．抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加等量含5～10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细

胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上，室温中，水平离心500×g20分

钟。此时离心管中形成5层：最上面是血浆，血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC，淋巴

细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又成为棕黃层。

2．吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出

PBMC。加1～2倍量含5IU/ml肝素、2％灭活小牛血清的Hanks液（洗涤液），混匀后离心

200×g10分钟，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。

3．再用同样洗涤液洗涤细胞2次，每次离心500×g10分钟，洗去残留的淋巴细胞分离液。

用1％台盼蓝染色检测细胞活力（应>95％）并计数细胞。再用含10％小牛血清的细胞培养

液将细胞配成适当浓度。通常，每毫升外周血可得1×106～2×106PBMC。

2）用尼龙毛分析T细胞

尼龙毛柱的制备（注意无菌操作）

1．取直径3D，长度约10cm的尼龙毛，用0.2mol/LHCl浸泡处理过夜。用双蒸水洗净HCl，

置37℃烘干备用。

2．称取50mg尼龙毛，均匀分散后置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夹

住。将尼龙毛均匀填塞入注射器中，排净空气，柱高约5～6cm。此柱可分离约2×107细胞。

将柱置－20℃可保存2～3个月。

分离细胞

1．取PBMC，用含10％小牛血清的RPMI-1640培养液将细胞配成2×107/0.5ml。

2．融化冻存的尼龙毛柱，以每分钟5～7滴的速度放出Hanks液。用5ml预温至37℃的细

胞培养液洗涤尼龙毛柱。将0.5ml上述PBMC悬液加入尼龙毛柱中，待细胞悬液全部进入尼

龙毛柱后，立即加0.2ml细胞培养液，夹住塑料管。

3．在37℃5％CO2饱和水汽二氧化碳培养箱中培养1小时，使细胞与尼龙毛充分粘附。

用5ml预温至37℃的细胞培养液洗脱尼龙毛柱。洗脱液中含有纯的T细胞。1000×g离心洗

脱液10分钟，去上清液。再用细胞培养液洗涤细胞1次。计数细胞，用细胞培养液将细胞

配成适当浓度。

室温下将25mL的富含白细胞的血液成分与等量淋巴细胞分离液混合,使用Ficoll-Hypaqu密

度梯度离心法,室温3000r/min,离心20min后收集单个核细胞.调节细胞浓度为106/mL,然

后在6孔板上贴壁,每孔加2mL,3h后吸去悬浮细胞,并用37℃预温新鲜培养液轻轻洗去未贴

壁的细胞