卡诺氏液

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，

达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和

冰乙酸混合液而称的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需

临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰

乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

水稻根尖染色体标本制备

作者:biozxp发布日期:2006-4-04查看数:22出自:

1.取材：选取水稻种子，充分浸种后，将它们摆在铺有滤纸的培养皿内，在约28℃条件下发芽培养，当胚根长

至1～1.5cm时，剪下备用。

2.预处理

压片法：采用0.1％秋水仙素处理2h左右

去壁低渗法可采用以下四种方法处理

处理方法0.002mol/L8-羟基喹啉α－溴萘饱和溶液低温（－4℃）卡诺氏Ⅰ固定液

处理时间（h）1242424

注：卡诺氏Ⅰ固定液乙醇：冰醋酸（3：1）

3.固定卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间以不超过24h为宜。

经过固定的材料如不及时使用，可经90％酒精换到70％酒精各半小时，再换入一次70％酒精，在0～4℃冰箱

内备用。

去壁低渗法

a.将3固定的材料用DDW洗净后，0.075mol/LKCL溶液室温条件下处理约30min。

b.酶解去壁吸取低渗液，加入1％混合酶液（1％果胶酶与1％纤维素酶的混合液，均为Sigma公司），28℃左

右，酶解4.5～5h.酶解过程中，将材料瓶轻轻摇动1～3次，使材料与酶液充分接触。

c.后低渗吸取酶液,用DDW冲洗材料2～3次，然后在DDW中停留30min。

d.重固定吸取低渗液后,加入新配制的卡诺氏Ⅰ固定液，固定时间约20min。

e.标本制备吸取固定液后，将根尖捣碎,再滴入新鲜固定液3～5滴，制成细胞悬液，充分搅匀。吸出细胞悬液

滴于清洁载玻片上。（为了使细胞悬液能充分散开，载玻片可预先放置于－20℃冰箱内保存，使用时取出）再将

载玻片于酒精灯下来回移动，烤片。

f.染色改良品红［11］染色30～50min。染色完毕，洗去染液，脱水透明，干燥后镜检。

根尖压片法

解离:将1.3固定好的材料用DDW冲洗2～3次，放入盛有1N盐酸（浓盐酸：DDW1：11）的小瓶中，在60℃

左右水浴锅中处理15min。解离完毕时,根尖分生区是乳白色,而根冠和伸长区则显透明。

染色:将材料水洗3～5次，注意，一定要将解离液冲洗干净，否则材料不易着色。改良品红染

色约5h。

压片:取染色完毕的根尖置于干净载玻片上，切除根冠，切下根尖分生区，加入一滴清水，盖上玻片后压片。

镜检，如果染色过深，可滴加一滴45％醋酸溶液分色。

附录二：常用固定液和染色液的配制

1.福尔马林-醋酸-酒精固定液(FAA)

50%或70%酒精90ml+冰醋酸5ml+福尔马林(37%~40%甲醛)5ml

可用作固定植物的一般组织,但不适用于单细胞及丝状藻类,也不适宜作细胞学研究。幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精，可防止材

略减冰醋酸，略增福尔马林。若材料易收缩，可稍增加冰醋酸。久置时另加入5ml甘油以防蒸发和材料变硬。此液又可作保存液。

用在植物胚胎的材料上，改用下面的配方，效果较好：50%酒精89ml+冰醋酸6ml+福尔马林5ml

2.福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）

福尔马林5ml+丙酸5ml+50%酒精90ml

固定一般的植物组织，通常固定24h，可长久保存。

3.酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoyfixative）

配方Ⅰ：纯酒精3份+冰醋酸1份

配方Ⅱ：纯酒精6份+冰醋酸1份+氯仿3份

适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。

4.酒精-福尔马林固定液

福尔马林2~6（6~10）ml+70%酒精100ml

固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。通常固定24h，亦可长久保存。

5.酒精-福尔马林-甘油固定液

95%酒精150ml+5%福尔马林100ml+甘油50ml

此液也可长期储存材料。

6.铬酸-醋酸固定液

根据固定对象的不同，可分为强、中、弱3种配方：

（1）弱液配方：10%铬酸2.5ml+10%醋酸5ml+蒸馏水92.5ml

（2）中液配方：10%铬酸7ml+10%醋酸10ml+蒸馏水83ml

（3）强液配方：10%铬酸10ml+10%醋酸30ml+蒸馏水60ml

弱液配方用在固定较柔软的材料，如藻类、苔藓和蕨类的原叶体等。固定时间较短，一般为数小时，最长可固定12~24h，但藻类和

几分钟至1h。

中液配方用于固定根尖、茎尖、未成熟子房和胚珠等。为了易于渗透，可在此液中加入2%的麦芽糖或尿素。固定时间12~24h。

强液配方用于固定木质根、茎、成熟子房等。为了易于渗透，可在此液中加入2%的麦芽糖或尿素。固定时间12~24h或更长。

7.铬酸-醋酸-福尔马林混合液

这3种药品混合在一起所配成的各种固定液，通常称纳瓦兴固定液（Nawashinfixative），简称Craf。配方见下表：

常备液

纳瓦兴

原液(ml)

纳瓦兴固定液(ml)

桑弗利斯液(ml)

ⅠⅡⅢⅣⅤ

甲

液

1%铬酸404040

10%铬酸1581013

铬酸1520206070

冰醋酸108

蒸馏水75454040322079

乙

液

福尔马林44

蒸馏水66

甲、乙两液均为贮备液，使用之前才将二者混合。适用于组织学和细胞学的研究材料。柔嫩而含水多的材料，可选用Ⅰ或Ⅱ固定，

用高浓度的Ⅳ或Ⅴ，一般材料多用Ⅲ。制作染色体和有丝分裂的纺锤体标本时，常用桑弗利斯固定液。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ固定液

桑弗利斯液固定时间为4~6h。

8.铬酸-锇酸-醋酸固定液（Flemmingfixative）

强液：10%铬酸水溶液3.1ml+2%锇酸的铬酸（2%）水溶液12ml+10%醋酸水溶液30ml+蒸馏水11.9ml

中液：10%铬酸水溶液0.33ml+2%锇酸的铬酸（2%）水溶液0.62ml+10%醋酸水溶液3ml+蒸馏水6.27ml

弱液：10%铬酸水溶液1.5ml+2%锇酸的铬酸（2%）水溶液5ml+10%醋酸水溶液1ml+蒸馏水96.5ml此固定液需现用现配。固定

物组织的固定。

t’s固定液

1%铬酸水溶液15ml+冰醋酸5ml+福尔马林80ml此固定液适用于固定丝状藻类和真菌。

附录二：常用固定液和染色液的配制

1.番红水液

番红0.1g溶入蒸馏水,定溶至100ml。

2.番红酒液

番红0.5g或1g溶入50%酒精,定溶至100ml。

3.固绿染液

固绿0.1g溶入95%酒精，定溶至100ml。

4.碘-碘化钾染液

碘化钾溶入100ml蒸馏水，再加入1g碘，溶解后即可使用。

5.苏丹Ⅲ（或Ⅳ）染液

将0.1g苏丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中，再加入70%酒精50ml。

6.改良苯酚品红染液

原液A：将3g碱性品红溶入100ml70%酒精，此液可长期保存。

原液B：将10mlA液加入到90ml5%苯酚水溶液中。

原液C：将55mlB液加入到6ml的冰醋酸和6ml的38%的甲醛中。

染色液：取C液20ml，加45%冰醋酸80ml，充分混匀，再加入1g山梨醇，放置14天后使用，可保存3年。

7.间苯三酚染液

将5g间苯三酚溶入100ml95%酒精（若溶液呈黄色，即为失效）。

8.中性红染液

将0.1g中性红溶入100ml蒸馏水，用时稀释10倍。

9.钌红染液

将5~10mg钌红溶入25~50ml蒸馏水，现用现配。

10.龙胆紫染液

将0.2g龙胆紫溶入100ml蒸馏水。现常用结晶紫代替。必要时可将医用紫药水稀释5倍后代用。

11.铁醋酸洋红染液

先将100ml45%醋酸水溶液置入200ml的锥形瓶中煮沸，移去火苗，然后慢慢地分多次加入1g洋红粉末（切记不可一次倒入）。待全部

并悬入一生锈的小铁钉于染液中，过1min后取出，使染色剂略含铁质，以增加染色性能。静置12h后过滤于棕色瓶中备用（置于

12.苏木精染液

苏木精的配方很多，常用的有如下3种：

配方Ⅰ：苏木精水溶液

0.5g苏木精溶入100ml煮沸的蒸馏水中，静置24h后可使用。

配方Ⅱ：代氏苏木精（Delarfield’shaematoxylin）

甲液：苏木精1g+无水酒精6ml

乙液：硫酸铝铵（铵矾）10g+蒸馏水100ml

丙液：甘油25ml+甲醇25ml

分别配制甲、乙两液，将甲液一滴滴地加入乙液中，充分搅拌后，放入广口瓶中用纱布蒙住瓶口，置于温暖和光线充足处7~10天，

置1~2月，至颜色变为深紫色后，过滤备用，可长期保存。

配方Ⅲ：爱氏苏木精（Ehrlich’shaematoxylin）

苏木精1g+无水或95%酒精50ml+蒸馏水50ml+甘油50ml+冰醋酸5ml+硫酸铝钾（钾矾）3~5g。配制时，先将苏木精溶于酒

馏水、甘油和冰醋酸，最后加入研细的钾矾，边加边搅拌，直到瓶底出现钾矾结晶为止。混合后溶液颜色呈淡红色，放入广口瓶中

化1~2月，至颜色变为深红色时即可过滤备用，可长期保存。

13.席夫试剂（Schiff’sregent）

将0.5g碱性品红溶入煮沸的蒸馏水，搅拌使其充分溶解。冷却至50℃时，过滤于棕色细口瓶中，加入10ml1mol/L盐酸。冷却至25

酸钾或钠（Na2S2O5或K2S2O5），振荡使其溶解，密封瓶口，置于黑暗低温处过夜。次日检查，若染色液透明无色或呈淡茶色，即

可加入少量优质活性炭（0.5~2g），振荡1min，置于4℃冰箱中过夜，过滤使用。此液配好后，应塞紧瓶塞，外包黑纸，贮藏于冰箱

14.硫堇染液

将0.25g硫堇粉末，溶于100ml蒸馏水中，即可使用。使用此液时。需用微碱性自来水封片或用1%NaHCO3水溶液封片，能产生多

15.亚甲基蓝染液

0.1g亚甲基蓝溶入100ml蒸馏水即可。

16.詹纳斯绿B（JanusgreenB）染液

5.18g詹纳斯绿溶入100ml蒸馏水，配成饱和水溶液。用时需稀释，稀释倍数应视材料而异。

17.苏木精-曙红(HE)染液

曙红（Eosin），酸性染料，为最优良的动物细胞染料，与苏木精配合使用（复染）对动物组织进行对比染色。

苏木精的染液的配方同上。曙红有以下配制方法：

配方Ⅰ：曙红0.5g+95%酒精100ml

配方Ⅱ：曙红0.5g+蒸馏水100ml

配方Ⅲ：曙红0.5g+95%酒精25ml+蒸馏水75ml

一、纺锤体阻断剂（Spindleinhibitor）

在有丝分裂过程中，随着纺锤丝的形成，染色体被牵引到一起难以观察其形态。纺锤体的形成在于细胞质和纺锤体成分的粘度

之间的平衡，因此，改变细胞质的粘度，即可破坏纺锤体形成，从而使得染色体均匀散开，且染色体缢痕区更为清楚。

在培养中使用的纺锤体阻断剂为秋水仙素，在终止培养前加入适量秋水仙素，使正在分裂的细胞停留在中期，以获得大量分裂

相供分析之用。秋水仙素的浓度范围比较宽，一般使用浓度0.05—0.8微克/毫升，在终止培养前处理2—4小时。但在实际工作

中需要借助浓度和处理时间来控制染色体的收缩程度。秋水仙素作用时间越长，被阻断的中期分裂相越多，但是染色体也越凝聚

和收缩，所以还视各实验室经验而定。

二、低渗液（hypotonicsolution）

低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，例如水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65M）、

氯化钾（0.075M）等。低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色

体铺展，同时可使粘附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075MKCl为低渗液（具体情况取决于实际操作，鉴于实验的连续性和稳定性，本实验室采用0.35%KCl），

其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短，②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，15－25分钟，以预实验条件为准。

三、固定液

固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效

果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称

的卡诺氏固定液是效果良好的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，

固定时间15分钟至24小时，冰箱、室温均可。必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺

展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

四、滴片

滴片使细胞悬液从一定高处落在载玻片上，淋巴母细胞膜破裂，染色体分散开。载玻片可用冰片和干片，效果均好。滴片后需

空气干燥。

五、Giemsa染色

Giemsa染料不是一种单一染料，而是天青、伊红、甘油和甲醇的混合物，配制后原液储存。在常规染色中，并不比其他染料

优越，但在显带技术中，却是无可比拟的。

Giemsa工作液在使用前临时配制，浓度可在2.5-10%之间（原液2份加pH7.4磷酸缓冲液10－40份）。染色后，染色质呈

红色，细胞核是蓝色。

五、台盼蓝染色

台盼蓝主要用来鉴定原代培养细胞时,细胞分离后的存活情况，用0.4%台盼蓝直接染色5-10分钟，在显微镜下观察即可，活细

胞不被染色。方便易用，因此在实验室中比较常用，尤其在心肌细胞原代培养中。