简并

简并引物设计的方法

简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克

隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。简并引物设计的常见

程序如下：1.利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA

编码的氨基酸序列。

因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以

氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条

相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr

数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

2.对所找到的序列进行多序列比对。

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对

程序如BLOCK，网址：nn.a...

ww/make_。也可选工具有ClustalW。

3.确定合适的保守区域。

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50～

400个氨基酸为宜，使得pcr产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守

区域至少有4个氨基酸。若比对结果保守性不是很强很可能找不到4个氨基酸

的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，

若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，

要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个4个氨基酸且两者

间距离合适的保守区域。

4.利用软件设计引物。

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用primer5.0进

行设计。但最好使用专门的简并引物设计的方法如：CODEHOP（网址：

/blocks/），GeneFisher2（网

址：/genefisher2/）。

在这里我们特别值得说明的是CODEHOP方法，该方法要求的保守区较短，而

且能有效的降低引物的兼并度，是一种非常有效的方法。该方法主要是通过将简

并区放在3′末端，并在5′端设计一个一致性的区域来降低兼并度，详见

/。

5.对引物的修饰

若得到的引物为：5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则其简并度＝

4×2×4×3×4×3×2=2304，很明显该条引物的简并度太高不利于pcr。我们可以通

过用次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤能很好的和4种碱基配对）和根据物种密码

子偏好这两种方法来降低简并度（有个查密码子偏好的数据库网址：

/viewthrea...ht=%C3%DC%C2%EB%D7%D3）。

注意：该方法设计出来简并引物对，适用于用于比对的氨基酸序列所属物种及与

这些物种分类地位相同的其他物种。

引物中符号说明：

A代表A

C代表C

G代表G

T代表T

M代表AorC

R代表AorG

W代表AorT

S代表CorG

Y代表CorT

K代表GorT

V代表AorCorG

H代表AorCorT

D代表AorGorT

B代表CorGorT

N代表GorAorTorC