引物二聚体

引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3’端，即使无法避免，其3’端互补

碱基也不应大于2个碱基，否则易生成引物二聚体Primerdimer。所谓引物二聚体实质上是

在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物长度相

近的双链DNA的片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。

形成引物二聚体原因

1,最根本的原因是引物之间或者自身存在互补序列。

2，模板量过低;

3,引物浓度多大;

4,退火时间过长.

可以通过下面的方法来减少引物二聚体：

1.适度减少引物的浓度（0.1－0.5pm）对于30轮放大足够

2.检查引物的自身结构，有无复杂的2级结构和FORWARD/REVERSE之间的配对，尤其是

3'端互补结构

反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长

时间，有认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。我试过，的确如此。

4.可以考虑加DMSO,甘油，BSA以及其他添加剂，解除引物二聚体。

5.如果PCR产物跑胶足够亮，可以考虑减少上样量，以及胶内显色物质（如减少EB的量）

一般PCR体系的引物和ｄＮＴＰ的量是过量的，产物浓度不够可以适当增加模板量，而不

是引物和ＮＴＰ。

PCR时，引物不要加太多，退火温度适当调高一点。

减少PCR产物中引物二聚体的方法:

1从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；

2.可能模板有问题；模板浓度过小，适当加大模板量；

酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4.取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于

冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；这点我试过,效果

还不错

5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO，可以增强特异性；

反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶，PCR结束后，产物勿放置在室温下过长

时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体。

7.增加循环数；

8.降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加

镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；

9.若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别，

则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对。

10.以上次的pcr产物作模板二次pcr，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如

果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100

倍；

不管是引物的哪一端形成了二聚体都会随着温度的上升而解开.而与延伸的时间和温度是

没有关系的,解开后它们就和其他单链一样有着平等的与模板结合的机会.而且这些半拉子

产物比引物更容易与模板结合,首先完成了合成全长单链(酶的催化速率不变,此时所需要的

时间当然短).也就是说到30个循环后,绝大部分都已经完成了全长链的合成,只有少部分形

成了长短不一的单链.(这已经不是引物二聚体了)

普通的PCR体系来说，30和34个循环的引物和dNTP的量没什么差别，一般来说这两个都

是过量的，循环数多了容易发生错配以及酶效率下降的现象，不过一般来说40以内没有什

么大问题。

看你的片段是600bp左右吗？如果是600bp那就用普通酶扩增即可，因为普通Taq酶在500bp

左右得到的片段是完全可信的，较大的片段可以用带有校正功能的酶来PCR。

如果你实验室经济条件较好的话，建议你选用高保真酶，或HotStart酶；还有个可选的方法，

就是直接把目的片段切胶回收，以回收得到的片段再做为模板进行PCR，这些就能得到大量

的目的片段，相信对于较小片段来说，这一点点的突变率可以忽略不计了。