引物稀释

引物溶解、分装需要注意的

首先拿到引物是要先快速离心一下，3000转1分钟，然后小心开盖，加水溶解，

至于加什么水，有几种不同观点，加好水后用盖上盖子来回混匀5-10分钟，也可

用漩涡振荡器，但不要太久，我震荡了好久，结果杯具了

于-20℃中，避免反复冻融。

。最后储存

观点1：引物在碱性条件下保存时间较长，双蒸水偏酸性，DNA容易降解，TE

BufferpH在7.5-8左右，弱碱性，所以我们建议用1×TEBuffer溶解引物，并保

存于-20度。

观点2：TE是弱碱性，适合于引物的保存，引物若在酸性下比较不稳定。用

ddH2O的话，更适合于后续的PCR操作。

观点3：注意工作液千万别用TE稀释,要用DEPC水,或去离子水稀释.因为TE可

以鏊合镁离子,镁离子对Taq酶活性发挥至关重要,影响PCR反应.。

小结：买试剂公司做好的无DNA/RNA酶的水溶解最好，但是那个水的PH是多

少我还不知道，下周一会送来，我测一下哈~另一个解决办

法是：TE水溶解成100uM储存液，利于保存，用时每次做100ul或者50ul的稀

释，用灭菌的ddH2O。

TEBuffer的配制方法

组成浓度：10mMTris-HCl

1mMEDTAPH=8.0

配制量：500ml

配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中

1MTris-HClBufferPH=8.05ml

0.5MEDTAPH=8.01ml

向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭

菌；室温保存.。

相关技术资料来自上海生工网站：

1.如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的吸光度来定量，请注意紫外分光光度

计的使用，测定时溶液的吸光度最好稀释到0.2-0.8之间(吸光度太高或太低会有

较大的误差)。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到

1ml并在1ml标准比色皿中测定其吸光度，即为所测体积的OD值，进而可以计

算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50μL稀释成

1ml并在1ml标准比色杯中测定的吸光度为0.25，说明该50μL中含有0.25OD的

DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

2.怎样溶解引物？

生工的合成报告单给出了每OD引物稀释为100μmoL/L（即100pmol/ul）浓度的

加水量，您可以根椐您的实验需要加入适量的无核酸酶的双蒸水（PH>6.0）或

TE缓冲液（PH7.5-8.0），开启瓶盖溶解之前最好在3000-4000转/分钟的转速下

离心1分钟，防止开盖时引物散失。

3.合成的引物应如何保存?

没有溶解的引物非常稳定，可以在-20℃下保存至少1年，溶解好的引物可以事先

稀释为100μmoL/L的储存液，分装数份保存于-20℃冰箱，可以保存至少半年以

上（反复多次冻融会降低使用寿命）。使用前，将浓溶液稀释成工作液（10

pmol/ml或20pmol/ml）后进行实验。

4.如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的一定浓度的聚丙烯酰胺

凝胶进行电泳,<12个碱基的引物用20%的胶，12-60个碱基的引物用16%的

胶，>60个碱基的引物用12%的胶，取0.2OD左右的引物，用尿素饱和液溶解或

引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃,2min)。加入尿素的目

的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后

(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂

带，说明纯度是好的(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二

级结构条带)。

5.一般的合成的引物在5'和3'末端有磷酸基团吗?

没有，5'和3'末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时需特别注明。

6.合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办?

PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。

1)引物和模板是否配对，同源性有多大?

2)引物本身是否有立体结构.

3)PCR反应用试剂是否能正常工作?

4)PCR仪是否工作正常?

5)PCR反应条件是否合适?

如果一切正常，还无法解决问题时，生工将为您免费重新合成引物。

7.测定了引物的OD值后发现A260/A280<1.8，引物的纯度合格吗?

由于核酸在260nm附近有强吸收，而蛋白质在280nm附近有强吸收，从生物体

内提取核酸时，常用A260/A280比值来评价核酸纯度(比值在1.8～2.0之间)，这

一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的

DNA/RNA则不同，序列很短(通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各

种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构

成的引物的A260/A280比值也不同，例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比

值会大大低于1.8。所以不能用A260/A280的比值来判断引物的纯度.

8.上海生工可以合成多长的序列？

由于用户和基因拼接的要求，生工很好地合成过不少于100碱基左右长度的长片

段。因为生工可以提高起始合成数量、加大合成用的试剂量、用PAGE纯化。如

果您的实验需要，生工愿意接受110碱基以下的订单。

产物经过克隆以后测序发现引物区与合成序列不相符合，怎么办？多数是

PCR过程和克隆过程中引入的错误。遇到这种情况，请您：

1)可以要求生工重新免费合成引物。

2)重新挑取克隆测序，会有找到正确克隆的可能.

10.如何将两条互补的单链退火形成双链？

用退火缓冲液(10mMTris,pH7.5-8.0,50mMNaCl,1mMEDTA)溶解引物,将要退

火的引物等摩尔数混合，总体积不要超过500微升，加热到95℃2mins，然后缓

慢冷却至室温(低于30度)即可。退火的产物可以放在4度待用。

11.使用3%的Agaro凝胶电泳分析合成的引物，发现有很多条泳带，为什么?

对引物进行电泳一定要使用变性PAGE电泳。由于引物是单链DNA，容易形成

复杂的立体结构，因此进行Agaro电泳时，容易出现多条泳带，更无法用

Agaro电泳进行定量了。

12.能否根据引物电泳后EB染色后条带的亮度对合成的引物进行定量?不能。因

为EB是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA分子为单链，只

有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EB染

色。由于不同引物的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相

同，也就不能根据EB染色带的亮度来对合成的DNA进行定量。

13.2OD的引物可以多少做次PCR反应？

一般来讲，20个碱基左右的2OD的引物最少可以做400次PCR反应。

合成粗产物中含有什么杂质？

DNA合成仪合成的粗产物，其中除了含有所需的目的DNA片段以外，还含有

合成反应过程中产生的目的片段短的失败片段以及脱保护基团产生的铵盐，生工

提供的引物已全部通过纯化去除短片段、通过脱盐去除盐分。

15.引物在常温下运输，会降解吗？

不会降解，干燥的引物在常温至少可以稳定存放二周以上。而一般的运输时间通

常都在1-3天，所以您收到的引物不会降解。

16.为何长链引物的收费要比短链引物要高？

通常在合成长链引物时，试剂的加入量要比短链引物要多很多，尤其是大于90bp

的碱基以上的引物，由于成本的增加，从而导致价格也要高一些。

PCR产物DNA测序错误的原因

一、Taq酶原因

生工现为世界上最大的合成DNA专业公司之一,每天为世界各地用户合成约2100

条引物。在这些大量的引物中大多用于PCR扩增,约有万分之五左右的在DNA测

序后,发现在引物部分有错误,错误大部分表现为丢失。许多用户认为这种错误完

全是生工合成错误造成的。实际上这种错误一部分是由于Taq酶固有的错误概率

造成的。请看如下示意图:

从图可以清楚的看出，引物部分也被Taq扩增，既然引物也被扩增，那么错误就

可能发生。那么化学合成DNA会不会发生错误呢?回答是否定的。错误无非有

两种:一是碱基被置换；二是碱基丢失。生工的80多台DNA合成仪全部为ABI

公司产品，ABI的DNA合成仪目前是世界上最可靠的，至今尚未听说过ABI的

DNA合成仪在合成一个碱基时(例如A)，却错误地加上另一个碱基(G,CorT)，丢

失更不可能。因为DNA合成是在固相上进行的，每一个碱基的合成包含了脱保

护基(DMT)、碱基的加成、盖帽(Capping)、氧化等步骤。如果说某一个碱基由于

种种原因(如瓶中溶液没有了，或管道堵塞)，未加入到正在延伸的Oligo上，那

么下一个反应Capping将会把Oligo封死，使整个oligo合成立即中止。

二、化学原因

在合成过程中，如果生工提供的DNA合成报告单是正确的，表示合成是成功

的。人为因素造成碱基突变的可能性是完全可以排除的。DNA合成专家Dr.

Hecker和对此作了一评论（ErrorAnalysisofChemicallySynthesized

PolynucleotidesBiotechniques，.24：256-60），认为化学合成的DNA片

段要比天然的DNA片段有更多的碱基突变概率。但其真正的化学机理还不太清

楚，但可以肯定的是要保证100％不发生错误是不可能的。ubkowski

在《NucleicAcidsRearch》(2002，Vol.30,No.10e43)上发表了一篇文章也证

实了化学合成引物（非人为错误）会导致错误，而且引物链越长，错误概率越

高。原文如下：whilethismethodissimpleinprinciple,inpracticenumerous

cethepossibilityoferrors

duringoligonucleotidesynthesis,theoligonucleotidesshouldberathershort,yetthey

muststillbelong

enoughtoprovidestableprimingoverlaps.

三、解决的办法:

1.建议用高保真的高温聚合酶，可有效的减少差错。

2.再挑选一个克隆进行DNA测序，一般来说再次出现错误的可能性就更小了。

3.重新合成引物。

4.将您有缺失碱基的克隆送到生工基因部，生工负责将缺失的碱基进行点突变，

提供您所需要的正确序列。但由于客户的载体非常复杂和多变，此方法并不完全

通用。