克隆的资料

克隆基因的步骤

姓名：王静马红梅施翔骞武洋梁丹罗星（指导老师）

克隆基因的步骤

摘要：基因是遗传物质的最基本单位，也是所有生命活动的基础，不

论是揭示某个基因的功能还是要改变某个基因的功能，都必须将所要

研究的基因克隆出来。本文将试验中的体会以及查阅文献后获得的知

识做一汇总，简述克隆基因中的步骤以及在操作中应该注意到的一些

问题。

关键词：基因克隆；质粒；重组

基因克隆可概括为∶分、切、连、转、选。"分"是指分离制备

合格的待操作的DNA，包括作为运载体的DNA和欲克隆的目的

DNA；"切"是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA，或者切

出目的基因；"连"是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接

起来，形成重组的DNA分子；"转"是指通过特殊的方法将重组的DNA

分子送入宿主细胞中进行复制和扩增；"选"则是从宿主群体中挑选出

携带有重组DNA分子的个体。

DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分

子，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。如果基因的

两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA或cDNA

中通过PCR技术可以获得目的基因。该试验为设计引物来获得目的

基因。

接下来选择载体，本次试验采用的是质粒载体，利用质粒进行

载体构建。载体构建的原理为：依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接

酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割

和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿

主细胞内的正确表达。

体外重组则可完成上述过程。体外重组即体外将目的片断和载

体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形

成有粘性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便

可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4DNA连接酶

的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。当目的DNA片断为平端，

可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端

相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带

有粘末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修

饰，如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，

可以获得相应的粘末端，然后进行连接。

其次，将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化，

转染，转导，重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中。

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的

转化子即阳性克隆的过程就是筛选。目前发展起来的成熟筛选方法

如下：插入失活法，PCR筛选和限制酶酶切法，核酸分子杂交法，免

疫学筛选法。提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因

已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。此次

试验中使用的是PCR筛选，即PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性

内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。上述方法获得的阳性克

隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。

在PCR反应中，参加PCR反应的物质主要有五种即：引物(PCR

引物为DNA片段）、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+）。

在进行转化时，取一管-80℃保存的感受态细胞，置冰上融化，

一次转化感受态细胞的用量为50-100ul,应注意所用DNA体积不要超

过感受态细胞悬液体积的十分之一。加入连接物（50ul的感受态细胞

能够被1ng超螺旋质粒DNA所饱和），轻轻旋转离心管以混匀内容

物，冰浴30min；将离心管置于42℃热击60-90秒，然后迅速置冰浴

2-3分钟，该过程不要摇动离心管；向每个离心管中加入500ul液体

LB培养基，混匀后置于37℃摇床振荡培养45分钟（150转/分钟）；

目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。

将离心管内容物混匀，吸取已转化的感受态细胞加到含相应抗

生素的LB固体琼脂培养基上（含卡列霉素），用无菌的弯头玻棒轻

轻将细胞均匀涂开。将平板置于室温直至液体被吸收，倒置平板，37℃

培养12-16小时。至红、白斑区分明显为止。涂布用量可根据具体试

验来调整：如转化的DNA总量较多，可取更少量转化产物涂布平板；

反之，如转化的DNA总量较少，可取转化产物涂布平板。如果预计

的克隆较少，可通过离心（4000rpm,2min）后析除部分培养液，悬浮

菌体后将其涂布于一个平板中。（涂布剩余的菌液可置于4℃保存，

如果次日的转化菌落数过少可以将剩下的菌液再涂布新的培养板）

最后进行挑菌PCR鉴定，要确定不要少加样试剂，因为都是微

量加入，所以每次加入时都应注意是否加入试剂，鉴定时常会出现假

阳性，即长出斑点的情况，而用PCR鉴定则无法鉴定出来，

在进行基因克隆的操作中，应注意的事项有：1、感受态细胞应

保存在-70℃，不可多次冻融和放置时间过长，以免降低感受态细胞

的转化效率。2、进行转化操作时，应根据相应温度及无菌条件的要

求进行。3、为防止转化试验不成功，可以保留部分连接反应液，以

重新转化，将损失降到最低。4、卡列霉素：使用前用无菌纯水配制

母液。5、挑单克隆时，一定要挑单一圆润的菌落，有卫星斑的不挑。

6、用接种环挑菌后，要在酒精灯上反复灼烧，然后再进行下一次挑

菌。7、连接产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后续实

验。8、在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间。9、连接反应

是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要参数之一就是温度，

因此要控制好连接温度。10、进行黏末端连接时，会产生一定数量的

载体自身环化分子，导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一

问题，常采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制

DNA片段的自身环化。

通过以上步骤可获取基因，并构建载体，完成对基因的进一步

研究。

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