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更新时间:2022-12-09 06:29:24 阅读: 评论:0

九年级语文试题及答案-表示说的词语


2022年12月9日发(作者:抒情诗)

iPSCs定向分化的内耳毛细胞与支持细胞间相互作用的研究

王翠翠;陈建玲;唐子华;邱世伟;张翠;李亮;郭维维;杨仕明;王金福

【摘要】目的利用诱导多能性干细胞定向分化的内耳毛细胞和支持细胞探究这两

种体外诱导分化细胞之间的相互作用.方法首先,利用细胞单层贴壁两步诱导法将三

株iPS细胞(野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株)向内耳祖细胞及内耳毛细

胞诱导分化,探究iPSCs定向分化内耳毛细胞的过程中是否有支持细胞的产生;其次,

通过细胞免疫化学的方法探究体外分化的内耳毛细胞和支持细胞间的相互作用;最

后,将表达绿色荧光蛋白(EGFP)的上皮样内耳祖细胞以圆窗膜穿刺的方法移植到白

化荣昌猪的内耳中观察分析移植细胞在体内的迁移、分化以及在体内形成的联系.

结果三株iPS细胞诱导分化为内耳毛细胞的过程中均有一部分细胞分化为支持细

胞;对分化细胞进行E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的免疫荧光检测结果显

示,E-cadherin、N-cadherin和ZO-1在支持细胞-支持细胞连接和支持细胞-毛细

胞连接间都有表达;移植4周后,耳蜗免疫组织化学结果显示,三株不同来源的移植细

胞均有少量细胞成功迁移到了毛细胞受损部位—柯底氏器,并表达毛细胞标志性蛋

白MYO7A.移植细胞之间以及移植细胞与宿主细胞之间有E-cadherin、N-

cadherin和ZO-1的表达.结论iPSCs诱导分化的内耳毛细胞和支持细胞在体内、

外均能形成钙粘连接和紧密连接.这些研究结果对毛细胞取代法治疗耳聋策略的完

善与发展有一定的科学意义.%ObiectiveToexaminetherelationships

betweeninnerearhaircellsandsupportingcellsfrominducedpluripotent

stemcells(iPSCs).MethodsNormaliPSCsderivedfromahealthydonor(C-

iPS),iPSCswithmyosin7Amutationderivedfromadeafpatient(P-iPS)and

iPSCswithmyosin7Acorrectedgenetically(CP-iPS)wereinducedto

differentiateintooticprogenitors,andthenOEPswereisolatedfromotic

progenitorsandinducedtodifferentiateintoin-nerearhaircell-likecells

fluorescencewasudtoexamineinvitro

formationofintercel-lularjunctionsbetweentheinducedhaircell-likecells

rmore,EGFP-OEPsderivedfromthreeiPSCs

weretransplantedintotheinnerearofalbinoRong-Changswineviaround

widowtoexaminethemigra-tion,differentiationandintercellular

sOEPsderivedfromiPSCscouldbe

inducedintohaircell-likecellsandsupportingcellssimultaneously,and

intercellularjunctionssuchasadheringjunctionsandtightjunctionswere

formedbetweenhaircell-likecellsandsupportingcellsderivedfromOEPs.

Aftertransplantation,thegraftedcellscouldmigratefromthescala

r,onlyalimitednumberofcellswere

integratedintothenativeauditoryepithelialtissue,andsomeEGFP-cells

integratedintotheorganofCortiandex-presdthehaircellmarker

MYO7A,indicatingthattheexogenouscellshaddifferentiatedintohair

rimmunolabelingassaysshowedproductionof

adheringjunctionproteins(E-cadherinandN-cadherin)andatight

junctionprotein(ZO-1)betweenthedifferentiatedcellsandothercells,

sionsCell-cellinteractions

suchasadheringjunctionsandtightjunctionsbetweenhaircell-likecells

andsupport-ingcellsderivedfromiPSCscanbeformednotonlyinvitro

esultsmayfacilitatethedevelop-mentofhaircells

replacement-badstrategyfordeafness.

【期刊名称】《中华耳科学杂志》

【年(卷),期】2017(015)004

【总页数】9页(P489-497)

【关键词】耳聋;诱导多能性干细胞(iPSCs);毛细胞;支持细胞;细胞间连接

【作者】王翠翠;陈建玲;唐子华;邱世伟;张翠;李亮;郭维维;杨仕明;王金福

【作者单位】浙江大学紫金港校区,生命科学学院,细胞与发育研究所杭州310058;

浙江大学紫金港校区,生命科学学院,细胞与发育研究所杭州310058;浙江大学紫金

港校区,生命科学学院,细胞与发育研究所杭州310058;解放军总医院耳鼻咽喉头颈

外科,解放军耳鼻喉研究所北京100853;浙江大学紫金港校区,生命科学学院,细胞

与发育研究所杭州310058;浙江大学紫金港校区,生命科学学院,细胞与发育研究所

杭州310058;解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科,解放军耳鼻喉研究所北京100853;

解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科,解放军耳鼻喉研究所北京100853;浙江大学紫金

港校区,生命科学学院,细胞与发育研究所杭州310058

【正文语种】中文

【中图分类】R764

Fundprojects:thegrantsfromNationalBasicRearchProgramof

China(2014CB541705);ChineNationalScience

Foundation(81570932);StrategicallyGuidingScientificSpecialProjectfrom

ChineAcademyofSciences(XDA04020202-23);NationalDevelopment

ProgramofImportantScientificInstrument(2013YQ030595);Opening

FoundationoftheStateKeyLaboratoryofSpaceMedicineFundamentals

andApplication(SMFA12K02);TZ-1ApplicationProgram(KYTZ01-0901-FB-

003).

Disclosureofpotentialconflictsofinterest:Authorsindicatenopotential

conflictsofinterest.

耳聋多数情况下由环境因素引起,比如频繁暴露在高强度的声音环境中、病毒感染

和耳毒性药物等等。由内耳毛细胞和神经细胞的缺失或损伤而导致的耳聋被称为感

音性耳聋,这是听力损伤中最常见的一种,影响着全世界数以百万计的人[1]。成

体哺乳动物的耳蜗毛细胞属于终末分化细胞,不具有再生修复能力,故由因其损伤

引起的感音神经性耳聋通常是不可逆的[2]。目前,针对感音性耳聋病人的常规疗

法主要是加装助听器和植入人工耳蜗,但由于毛细胞的不可再生性,这些手段并不

能从病理上根治耳聋。近年来干细胞技术的发展为耳聋的治疗提供了一个崭新的更

具前景性的方向[3,4]。胚胎干细胞(ESCs)和诱导多能性干细胞(iPSCs)在体外

已经被成功诱导成内耳毛细胞样细胞[5,6]。近来有研究表明基因突变导致毛细胞

损伤的耳聋病人来源的特异性iPSCs经基因校正后能产生形态和功能均正常的内

耳毛细胞样细胞[7,8]。这种把诱导多能干细胞(iPS)技术和基因校正技术结合的

研究将为毛细胞取代法治疗感音性耳聋提供无限可能。

耳蜗螺旋器(OrganofCorti)是感受声音刺激的听觉感受器,主要由毛细胞和支

持细胞组成。毛细胞不能直接附着在基底膜上,而是由支持细胞所依托和包绕,这

说明毛细胞在机械和生理很大程度上由支持细胞维持[9]。不同于毛细胞仅仅是附

着在基底膜的表面,支持细胞可以横跨整个基底膜。支持细胞之间以及支持细胞和

毛细胞之间通过钙粘连接和紧密连接建立起联系[10,11],支持细胞之间还可以通

过间隙连接进行离子交换[12]。支持细胞在感觉上皮发挥着重要的作用,不仅可以

维持感觉器官结构的完整性,而且可以维持上皮细胞的生存环境使毛细胞可以正常

发挥功能[13]。支持细胞在非哺乳动物毛细胞损伤后的感觉修复方面也发挥了重要

的作用。在非哺乳动物中,支持细胞利用有丝分裂再生和非有丝分裂再生两种机制

来代替受损的毛细胞[13]。某些情况下,支持细胞作为祖细胞可进入细胞周期,持

续分裂产生出成熟的毛细胞和支持细胞,以替代消失的毛细胞;其他情况下,支持

细胞还可以不通过有丝分裂直接转分化为毛细胞。相比之下,在哺乳动物和人类的

前庭系统,在毛细胞损害后出现非常有限的祖细胞分裂为再生的毛细胞,而在耳蜗

系统,毛细胞不可再生。

因此,深入了解iPSCs诱导分化的内耳毛细胞与支持细胞之间的相互作用关系是

iPSCs用于毛细胞功能修复研究的重要前提条件。本文中,我们采用三株iPS细胞

(野生株、MYO7A缺陷株、MYO7A校正株)进行内耳毛细胞的诱导分化。首先,

鉴定了在iPSCs定向诱导分化内耳毛细胞的过程中同时产生了支持细胞。其次,

通过检测钙粘连接蛋白(E-cadherin、N-cadherin)和紧密连接蛋白(ZO-1)的

存在与分布初步确定体外诱导分化的内耳毛细胞与支持细胞之间的关系。最后,我

们将表达EGFP的上皮样祖细胞通过圆窗膜穿刺的方法移植到白化荣昌猪的内耳中

观察分析细胞的迁移、分化以及细胞连接。

1.1实验细胞株和动物模型

所有的实验过程包括涉及到的动物都通过了杭州市浙江大学伦理审查委员会的批准。

由浙江省卫生局批准,并且经过浙江省温岭市第一人民医院伦理委员会同意,我们

成功采集到正常非耳聋患者、MYO7A杂合双突变耳聋病人的及其父母的尿液。

C-iPSCs由正常非耳聋患者(MYO7AWT/WT)的尿液细胞经重编程诱导生成;

P-iPSCs由MYO7A杂合双突变耳聋病人(MYO7Ac.1184G>A和MYO7A

c.4118C>T)的尿液细胞经重编程诱导生成;CP-iP⁃SCs是利用CRISPR-Ca9

技术将P-iPSCs中c.4118C>T突变位点校正之后得到的细胞株[7]。

Mitf-M基因突变的白化荣昌猪是由中国人民解放军总医院耳鼻喉研究所提供,猪

龄8周左右,体重约10Kg。

1.2实验方法

1.2.1iPS细胞向内耳祖细胞及进一步向内耳毛细胞诱导分化

本研究中,我们利用细胞单层贴壁两步诱导法[6],首先用FGF3和FGF10处理人

iPS细胞10-12天,使其分化为内耳上皮样祖细胞。在第二步的向毛细胞方向诱导

过程中,我们将细胞接到用laminin包被过的细胞爬片上,用添加了全反式视磺

酸和EGF的鸡胚椭圆囊基质细胞条件培养液培养20天,这种诱导方法已经证实可

以产生具有静纤毛束和电生理特性的毛细胞样细胞[15]。

1.2.2内耳祖细胞、内耳毛细胞的基因表达检测

使用Trizol试剂(TaKaRa)提取待检测样本的总RNA。使用逆转录酶

(Fermentas)从2μg总RNA合成cDNA,用作聚合酶链反应(PCR)中的模板。

推荐的引物和产物大小见表1。使用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像分析系统分析反应

产物。使用Im⁃ageJ软件对带强度进行半定量分析。

1.2.3细胞免疫荧光

待测样品用4%多聚甲醛室温下固定15min,0.01MPBS洗涤3次,每次5min;

0.25%TritonX-100室温下孵育样品10min,0.01MPBS洗涤3次,每次5min;

1%牛血清白蛋白封闭1h。加入一抗(an⁃ti-PAX8,1:100,Abcam;anti-PAX2,

1:250,Abcam;anti-Nestin,1:250,Abcam;anti-SOX2,1:900,

Ab⁃cam;anti-ATOH1,1:500,Abcam;anti-BRN3C,1:50,Abcam;

anti-Myosin7a,1:500,Abcam;anti-Espin,1:200,SantaCruz;anti-

p27Kip1,1:100,R&DSystem;anti-ZO-1,1:100,ThermosFisher;

an⁃ti-E-cadherin,1:50,BDBiosciences;anti-N-cad⁃herin,1:50,BD

Biosciences)4℃孵育过夜。0.01MPBS洗涤3次,每次5min。加入1:400二抗

(AlexaFlour594,AlexaFlour488,AlexaFlour405,Jack⁃son)避光室温

孵育1h。0.01MPBS洗涤3次,每次5min。加入DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲

哚;Beyo⁃time),避光室温作用1min,0.01MPBS洗涤5min。封片,进行共聚

焦扫描成像。

1.2.4稳定表达EGFP的上皮样祖细胞(EGFP-OEPs)的制备及移植

慢病毒感染的方法使iPS细胞稳定表达荧光标记蛋白EGFP,得到稳定的EGFP-

iPS细胞株;由EGFP-iPS诱导分化了12天的内耳祖细胞利用差异消化法去除祖

细胞中较早消化下来的神经祖细胞(ONPs),收集之后消化下来的上皮样内耳祖

细胞(OEPs)用DMEM/F12配制成1×105个/μl的细胞悬液,4℃保存备用。

对动物的右耳进行手术,暴露圆窗,将提前准备好的EGFP-OEPs细胞悬液轻轻吹

打均匀,吸入10μl于微量进样器中,刺穿圆窗膜将细胞悬液缓慢注入耳蜗鼓阶,

用明胶海绵填塞圆窗龛,逐层缝合切口,碘伏消毒伤口。

1.2.5组织学切片免疫化学分析

荣昌猪经4%多聚甲醛灌注后,解剖内耳取出耳蜗;将耳蜗浸泡在4%多聚甲醛中

固定过夜;10%EDTA常温脱钙4周;0.01MPBS缓冲液漂洗后转移到30%蔗糖

溶液中4℃脱水过夜;0.01MPBS缓冲液漂洗后浸泡在OCT包埋剂中4℃过夜后

进行冷冻切片。0.01MPBS缓冲液漂洗三遍,每遍15min,洗去OCT包埋剂,

5%BSA室温封闭1h,加入一抗(anti-EGFP,1:3000,Abcam;anti-Myosin

VIIa,1:500,Abcam;anti-ZO-1,1:100,ThermosFisher;anti-E-

cadherin,1:50,BDBiosciences;an⁃ti-N-cadherin,1:50,BDBiosciences)4℃

孵育过夜。0.01MPBS洗涤3次,每次15min。加入1:400二抗(AlexaFlour

594,AlexaFlour488,AlexaFlour674,Jackson)避光室温孵育1h,0.01M

PBS洗涤3次,每次5min。加入DAPI(4,6-二脒基-2-苯基吲哚;Be⁃yotime,),

避光室温作用1min,0.01MPBS洗涤5min。封片,进行共聚焦扫描成像。

2.1iPS细胞向内耳祖细胞及进一步向内耳毛细胞诱导分化

三株不同来源的iPS细胞通过单层贴壁诱导分化的方法,在FGF3和FGF10同时

存在的内耳祖细胞诱导分化培养液中培养12天后进行基因检测和免疫荧光检测。

RT-PCR分析显示,Pax2以及内耳早期发育特异性基因(如Pax8,Dlx5,Six1,

Eya-1和GATA3)在诱导细胞中均表达(图1A);三株细胞分化来的内耳祖细

胞在基因表达方面并无明显差异(图1B,P>0.05)。对内耳祖细胞标志性基因

PAX8和PAX2(图1C),PAX8和SOX2(图1D),PAX8和Nestin(图1E),

进行免疫共标检测,结果表明,三株iPS细胞均能诱导分化为内耳祖细胞。

收集OEPs并在补充有EGF和全反式视黄酸的鸡胚椭圆囊基质细胞的条件培养基

上培养3周后进行基因检测和免疫荧光检测。RT-PCR分析显示,在诱导的毛细胞

样细胞中表达毛细胞转录因子ATOH1和BRN3C、早期毛细胞结构蛋白MYO7A

以及毛束发育所需的蛋白质ESPN(图2A);三株细胞分化来的内耳毛细胞在基

因表达方面并无明显差异(图2B,P>0.05)。我们对内耳毛细胞标志性基因

BRN3C和ATOH1(图2C),BRN3C和MYO7A(图2D),BRN3C和ESPN

(图2E)进行免疫共标检测,结果表明,三株iPS细胞均有向内耳毛细胞分化的

能力。

2.2iPS细胞体外诱导分化的内耳毛细胞样细胞和支持细胞间的相互作用

有文献报道,在内耳的发育过程中,内耳毛细胞和支持细胞来自于同一种前体细胞

[16]。因此,我们推测在iPS体外诱导分化为内耳毛细胞的过程中有一部分细胞分

化为支持细胞。为了证实这一推测,我们将三株不同来源的iPS细胞诱导分化成的

内耳毛细胞固定后用免疫荧光特异性标记支持细胞的标志性基因p27kip1。免疫

标记显示,分别有13.1%±2.7%、14.1%±2.9%和12.7%±2.7%的细胞表现为

p27kip1和myosin7A双阳性(图3A,B),我们将这类细胞视为未完全分化的

处于分化初期的毛细胞;分别有7.6%±1.5%、9.1%±0.9%和7.2%±1.7%的细胞

仅表达p27kip1,而没有表达myosin7A(图3C,D),我们将这类细胞视为支持

细胞[17]。

此后,我们探究诱导分化成的毛细胞和支持细胞之间是否存在形态上的联系。E-

cadherin和N-cadherin是钙粘蛋白家族中存在于钙粘连接中的两种经典的跨膜

糖蛋白,ZO-1是检测紧密连接的一种常用蛋白。于是,本实验中我们通过特异性

检测E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的存在和分布来判定毛细胞和支持细胞之

间在形态上的关系。结果表明E-cadherin(图4A)、N-cadherin(图4B)和

ZO-1(图4C)在毛细胞-支持细胞之间以及支持细胞-支持细胞之间都存在。

2.3移植细胞在白化荣昌猪内耳中的迁移、分化及细胞间连接

移植四周后,免疫组化结果显示,移植细胞大部分以细胞团的形式存在于鼓阶,小

部分细胞迁移到了中阶,其中只有极小部分细胞迁移到了毛细胞损伤部位-柯底氏

器(图5A)。为探究OEPs在耳蜗微环境中的分化潜能,我们对毛细胞标志物

MYO7A进行免疫荧光检测,结果表明,迁移到柯式器上的细胞部分呈MYO7A

阳性(图5B),初步断定迁移到柯底氏器上的细胞可以成功分化为毛细胞。最后,

我们特异性检测钙粘连接蛋白E-cadherin和N-cadherin以及紧密连接蛋白ZO-

1的表达情况来探究体外已经证实过的存在于毛细胞和支持细胞之间的钙粘连接和

紧密连接是否在体内依然能够形成,结果显示,移植细胞分化后相互之间依然有

E-cadherin(图6A)、N-cadherin(图6B)和ZO-1(图6C)的表达,且少量

移植细胞与宿主组织之间也有E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达。通过对

三株细胞株的比较发现,三株不同来源的上皮样祖细胞在内耳中的迁移、分化以及

E-cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达和分布方面并没有明显的差异。

随着干细胞技术的发展,越来越多的科学家尝试利用干细胞替换损伤的毛细胞[18-

20]和听觉神经元[21-25]的方法来治疗耳聋。WeiChen等人将hESCs体外诱导

分化成的内耳祖细胞移植到成年的耳聋沙鼠模型中,发现细胞不仅成功分化成了螺

旋神经元细胞,而且产生了实质性的功能恢复,这为将来的基于干细胞取代的听觉

神经性耳聋的治疗提供了很有前景的发展方向[6]。毛细胞被看作是耳聋治疗的重

要靶点,它的取代是听力恢复的最彻底的治疗。然而,几乎没有研究表明外源细胞

已成功取代受损的毛细胞并改善听觉功能,这可能是由于外源细胞很难整合进宿主

组织。在体内,支持细胞可以维持上皮细胞的生存环境,对毛细胞发挥功能起着重

要的作用。因此,深入了解干细胞体外诱导分化的内耳毛细胞样细胞与支持细胞之

间的相互作用关系可能会为外源细胞在宿主组织上的整合提供一定帮助。

在所有的内耳感觉上皮中,毛细胞和支持细胞的有序排列对于听力是必须的。在感

觉上皮的表面,毛细胞和支持细胞的质膜通过粘附连接和紧密连接相互作用,形成

对柯底氏器的结构完整性至关重要的网状层[11]。粘附连接主要通过机械的连接相

邻的细胞以保持组织的完整性,而紧密连接主要是通过形成一个离子渗透屏障来保

证内淋巴液和外淋巴液的离子环境[26]。在网状层中介导接触的重要分子之一是钙

粘素,一种参与钙依赖性细胞间粘附的跨膜糖蛋白家族,这个家族包括E-

cad⁃herin、N-cadherin和P-cadherin。有研究已经证明,在成年哺乳动物的柯

底氏器上,钙粘蛋白存在于毛细胞-支持细胞异型连接之间和支持细胞-支持细胞同

型连接之间[10,27]。紧密连接由多种蛋白质组成,包括

Occluding[28],claudins[29],zonulaoc⁃cludensZO)家族和其他细胞质蛋白。

紧密连接蛋白ZO-1存在于支持细胞-毛细胞异型连接和支持细胞-支持细胞同型连

接中[11]。于是,我们通过检测粘附连接蛋白(E-cadherin和N-cadherin)以及

紧密连接蛋白(ZO-1)的分布探究体外诱导的毛细胞与支持细胞之间的关系。

为了探究移植的外源细胞能否迁移到柯底氏器中并与宿主细胞建立起联系,我们将

三株不同来源的上皮样内耳祖细胞移植到白化耳聋荣昌猪的内耳中。以往进行的利

用细胞取代策略治疗耳聋的研究中,大家常选用小鼠,大鼠和其他啮齿类动物。而

在我们这次的研究中,采用小型猪作为动物模型。与传统耳科研究中使用的啮齿类

动物相比,小型猪的优势在于其与人类基因组的高度同源性,以及其在内耳解剖、

内耳形态及电生理等方面与人的相似性[32]。本次实验采用的荣昌猪具有Mitf-M

基因突变,可使血管纹发生病变,耳蜗发育不良,螺旋神经节细胞和毛细胞数量减

少,从而导致感觉神经性耳聋[14]。我们这次研究的主要目标就是探究移植的外源

细胞在内耳中的迁移、分化以及在柯底氏器中细胞之间建立连接的情况。移植四周

后,我们在柯底氏器周围靠近盖膜的地方发现了EGFP标记的细胞,这和以往的研

究结果大体一致[33]。这些结果表明外源细胞可以从鼓阶迁移到中阶。然而,只有

极少数量的细胞整合到听觉上皮组织中。这可能是由于我们的动物模型是一种先天

性耳聋模型,其耳蜗病变不是急性损伤,因此不能发生炎症反应,并且在微环境中

没有炎症细胞因子有效地促进外源细胞与听觉上皮组织的整合[34]。在整个研究过

程中,我们均采用三种不同来源的iPS细胞株同时进行实验,结果对比发现,三株

不同来源的iPS细胞诱导分化的支持细胞和内耳毛细胞样细胞之间在体外和体内均

能形成钙粘连接和紧密连接,并且在E-Cadherin、N-cadherin和ZO-1的表达

和分布方面并无明显差异。因此,我们初步推测MYO7A基因突变对于毛细胞和

支持细胞间连接没有明显影响。当然,在本研究中使用的动物模型不是最佳的,特

别是对于源自CP-iPSC的细胞的移植实验。我们正在寻找MYO7A突变的动物模

型,并将探究CP-iPSC来源的细胞对体内毛细胞的形态和功能的恢复效应。

本研究通过一系列实验得到最终结论:iPSCs诱导分化的内耳毛细胞和支持细胞在

体外和体内均能形成钙粘连接和紧密连接。更好的了解干细胞体外诱导分化的毛细

胞与支持细胞之间的关系有助于基于毛细胞取代的干细胞治疗耳聋的进一步研究和

发展。

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