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猪瘟病毒RT-PCR检测试剂盒使用说明书

用途

猪瘟病毒(CSFV)反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测试剂盒，用于检测疑似感染动物

的血清或组织中的CSFV，适用于CSFV的检测、诊断和流行病学调查。该试剂盒不能用于

区分强弱毒。

原理

名称10头份50头份贮藏条件

0.2mL薄壁PCR管15个60个

室温(A盒)

吸附柱和收集管10套50套

裂解液6mL30mL

洗液12mL60mL

洗脱液1mL10mL

矿物油300µL1.2mL

50倍TAE电泳缓冲液20mL100mL

染色液20µL50µL

上样缓冲液50µL250µL

阴性对照350µL1mL

-20℃(B盒)

阳性对照350µL1mL

RT-PCR反应液200µL1mL

酶混合液15µL65µL

利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA为模板，以引物为起

点合成与RNA模板互补的cDNA链。在TaqDNA聚合酶的作用下，经高温变性、低温退火、

中温延伸的循环，使特异DNA片段的拷贝数放大一倍。经过35次循环，最终使扩增DNA

片段放大了数百万倍。将扩增DNA片段进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见

到DNA片段的扩增带。

试剂

1．试剂盒组成

2．试剂盒保存期：6个月。

需要自备的器材

1．仪器：分析天平、离心机、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪(或紫外分

析仪)、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器(2µL、20µL、200µL、1000µL)。

2．耗材：眼科剪、眼科镊、称量纸、20mL一次性注射器、生理盐水、琼脂糖、500mL量

筒、500mL锥形瓶、经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理的灭菌1.5mL离心管和吸头(10µL、

200µL、1000µL)、灭菌双蒸水。

使用注意事项

1．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。2．PCR整个试验分配液区、模

板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区

模板提取区扩增区

电泳区。严禁器材和试剂倒流。

3．所有试剂应在规定的温度储存，-20℃保存的各试剂使用前应放于室温完全融化，使

用后立即放回-20℃。

4．染色液低毒，应于室温条件避光保存，操作时应戴上手套。

5．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将红盖管8000rpm离心15s，使液体全部沉于

管底，放于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。

6．不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。

7．在RNA提取过程中，避免RNA酶污染，尽量缩短操作时间。

8．严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。

9．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在3次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。

样品制备

1样品采集：病死或扑杀的猪，取扁桃体、淋巴结等组织病变部与健康部交界处组织；待

检活猪，用注射器取血5mL。2～8℃保存，送实验室检测。(要求送检病料新鲜，严禁反复

冻融。)2样品处理：每份样品分别处理。

1.1组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取

0.05g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理盐水继续研磨，待匀浆后转至1.5mL灭菌离心

管中，8000rpm离心2min，取上清液100µL于1.5mL灭菌离心管中。

2.2全血样品处理：待血凝后取血清100µL，置1.5mL灭菌离心管中。

3.3阳性对照处理：取阳性对照100µL，置1.5mL灭菌离心管中。

4.4阴性对照处理：取阴性对照100µL，置1.5mL灭菌离心管中。

操作步骤1病毒RNA的提取

1.1取已处理的样品、阴性对照和阳性对照，分别加入裂解液600µL，充分颠倒混匀，室

温静置3～5min。

1.2将液体吸入吸附柱中(吸附柱要套上收集管，吸取液体时尽量不要吸到悬浮杂质，以免

离心时堵塞吸附柱)，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集管。

1.3向吸附柱中加入600µL洗液，13000rpm离心30s，弃去收集管中液体，套上收集

管。

1.4重复步骤1.3。

1.5再空柱13000rpm离心2min。

1.6将吸附柱移入新的1.5mL离心管中，在膜中央加入洗脱液25µL，室温静置1min，

13000rpm离心30s，获得总RNA。2RT-PCR操作程序

每份总体积20µL，含16.8µLRT-PCR反应液(用前混匀)，1.2µL酶混合液，2µL模

板RNA。

例如：n份样品(n<10)，配制n+1份，16.8×(n+1)RT-PCR反应液，再加入

1.2×(n+1)酶混合液混匀，取18µL分装成n份，分别加入2µL模板RNA，加入矿物油

20µL覆盖(有热盖的PCR扩增仪不用加矿物油)，作好标记。

在PCR扩增仪上进行以下循环：42℃45min，95℃3min；扩增条件为95℃30s，

60℃30s，72℃25s，35个循环；72℃延伸10min。3电泳

称4g琼脂糖放于500mL锥形瓶中，加入50倍稀释的TAE电泳缓冲液200mL(取

4mL50倍TAE电泳缓冲液，用双蒸水稀释至200mL)，于微波炉中熔解，再加入10µL染

色液混匀。在电泳槽内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待凝固后将PCR扩增产物10µL混合

2µL上样缓冲液，点样于琼脂糖凝胶孔中，以110～120V电压于50倍稀释的TAE电泳缓

冲液中电泳，紫外灯下观察结果。

结果判定

阳性对照出现272bp扩增带、阴性对照无带出现(引物带除外)时，实验结果成立。

被检样品出现272bp扩增带为猪瘟病毒阳性，否则为阴性。

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