于加皿

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细菌总数监测常见误差分析

细菌菌落总数是水源地和地面废水样品检测必做的一项指标。菌落总数检

测同其他检验一样，也存在检测误差。平板计数法是细菌总数常用方法之

一，因此，该值准确与否直接关系水质好坏。微生物平板计数的通常方法

为每个样品用3个稀释度，每个稀释度常做3个重复。但如何对平板菌落进

行正确计数、3个稀释度以哪一个稀释度进行计数及微生物检测允许误差等

问题，在饲料标准中并未有所规定，而这些问题与统计值的准确性密切相

关。我们就实际检测芽孢杆菌工作中遇到一些菌落计数的问题，与大家进

行探讨。

1材料与方法

1．1试验材料

1．1．1样品：随机抽取微生态饲料添加剂合生素样品3份。

1．1．2培养基：营养琼脂。

1．1．3仪器设备：磁力搅拌器，无菌培养皿，培养箱，振荡器。

1．2试验方法

1．2．1样品的振荡时间对菌数检测的影响

选择1个样品，称取10g，放人无菌锥形瓶内，加入90mL无离子水，

磁力搅拌分别为l0、20、30、40和60rain。用1mL移液枪从中吸取1mL样

品悬浊液加入到盛有9mL去离子水的试管中，用振荡器使样品充分均匀，

以此类推，制成10一～1O一’不同稀释度的样品溶液。平板涂布法检测菌

含量：用移液枪从样品稀释液中各吸取200L，每个样品稀释液3个重复；

将平板倒置于35—37cC培养箱中培养24h。

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1．2．2检测方法对菌数检测的影响

各个样品称取l0g，放入无菌锥形瓶内，加入90mL无离子水，磁力搅

拌分别为40rain。并稀释成10～～l0不同稀释度的样品溶液。倾注平板

法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释液中各吸取1mL，每个

样品稀释液3个重复，待培养基表面干燥后，将平板倒置于3537~(2培养箱

中培养24h。平板涂布法检测菌含量：用移液枪从各个平行样品相应稀释

液中各吸取200L涂布平板，每个样品稀释液3个重复；将平板倒置于35～

37℃培养箱中培养24h。2结果

2．1样品的振荡时间对菌数检测结果的影响

采用细菌平板计数的方法，不同振荡时间对合生素中芽孢杆菌检出量

的结果见表1。从表l中可见：不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差

别。总体而言，在一定时间内，随着振荡时间的延长检出有效菌含量增加，

说明细菌从载体上解析需要一定的时间；当振荡时间为40rain后产品中的

菌含量基本稳定。采用适当振荡时间才能更精确的显示产品中有效菌的含

量。表1震荡时间对有效菌含量结果的影响'["／_．CFU／g

震荡时间对有效菌落含量结果的影响

震荡时间

10分钟20分钟30分钟40分钟60分钟

含菌量2610.21514

3分析与讨论

3．1样品处理对结果的影响

取样时对样品取样口和取样工具要消毒，防止样品交叉污染。

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3．2样品的均质处理对结果的影响

固体样品要用均质器或玻璃珠等充分均质，也可在稀释液中添加相应

溶解液f如吐温80和液体石蜡等1的稀释液，以保证样品的充分均质。测定

芽孢杆菌活菌数时，不同振荡时间获得的细菌菌落数量有较大差别，因为

细菌从载体上解析并均匀分散到溶液中需要一定的时间，待测样品应在振

荡器上充分振荡，使得芽孢杆菌可以充分和均匀地分散到待测溶液中，避

免因为菌体未完全释放而引起结果中细菌含量偏低的现象。

3．3试验过程中操作方法的影响

加样lmL时，用1mL的吸管并且每做一个稀释度都要换1支吸管，否则稀释

度间菌落计数误差会超过10％，说明存在操作误差。用吸管向平皿里加样，

平皿开口要小，吸管要直立且加样结束后，让吸头接触皿底干燥处，保证

加样的体积不少。若采取倾注平板法时，平皿加样后要及时倾注琼脂，其

间隔一般不超过20minf最好在10min内)。以琼脂不烫手(约45℃)为宜，

否则会杀灭细菌，太热也会使冷凝水过多，影响细菌的生长。加入琼脂要

及时摇匀，先向一个方向旋转，然后向另一方向旋转。这样会减少菌落的

集聚和连片现象。另外，用力不要过大，使琼脂不溅到ⅡIL壁和肌盖上，

保证计数结果的准确。当琼脂凝。当琼脂凝固后，要及时移人培养箱倒置

培养。若采用涂布平板法进行检测，放置适当时间后，则立即将平皿翻转

后放置培养箱中进行培养，以避免菌落蔓延生长，难以计数。为保证结果

准确，除作琼脂的空白对照外，还要对菌落计数的全程做一对照。

3．4菌落计数误差

菌落计数在完成培养后应立即进行，以防菌落继续生长蔓延从而影响测定

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结果。培养基中加入

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TrCf氯化一苯四氮唑)可使细菌菌落显红色，这样可与同样品颗粒和凝集

物(白色)相区分，以提高菌落计数的准确性。有学者认为：100mL培养基

中加入2～3mL的TTC可使菌落着色且不抑制细菌的生长。菌落计数时要2个

人分别用菌落计数器计数菌落总数，取2个人的平均数报告菌落总数。一般

来说，每平板含20～200个菌落的稀释度的菌含量与实际结果最接近，超过

200个／平皿或小于2O个／平皿的计数结果则可能与实际存在较大差别。因

此，应尽量选择20～200个／平皿的稀释度进行芽孢杆菌的计数，保证菌落

计数的有效性。报告结果要遵守国标中菌落计数的方法进行。

4小结

菌落数检测的误差可能来自于多个方面。试验研究表明：除了检测环境和

培养基之外，误差主要来自于样品和检验的操作过程，包括检验的准备环

节。一般认为，微生物样晶不能复检。但当菌落总数在标准的临界或菌落

出现明显的异常时，有时重新检测还是必要的。这里所提到的重新检测是

对同一批次未开封且保存的时间和温度都比较合适的样品。这样，可以通

过重新检测校正误差。

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