cdna是什么

Q：做反转录PCR时，提取的RNA该怎么用DNAa1处理？

A：DNAaⅠ处理的目的是去除基因组DNA，PCR后不会有基因组DNA污染，扩出的

是没有n内含子的cDNA，从而降低做定量PCR的误差。

我原先也想买DNAa处理我提取的RNA，但是听我们实验室的人说效果不好（我不知道

具体不好的原因），而且增大RNA降解的机会，所以我就没有处理，直接RT了。接下去就

打算跨内含子设计引物做后续的荧光定量PCR（现在还没有做，呵呵~）。

我看见有人是这样处理的(不知到对你是否有用):

把酶加到TE溶液中（用RNa-Free的水配），先配成10mg/ml的母液后煮沸15min，冷

却后放冰箱-20度保存，用时稀释50倍，100倍看你自己了，然后就是混合RNA，37度处

理三十分钟。你可以问试剂供应商要一张DNAa的试剂说明书，我想，如果是好的试剂，

里面都有说明说的，而且说得比较清楚。

Q：现在已经提取出总RNA了，需要做逆转录成cDNA，然后再做荧光定量PCR来观察基

因表达量的多少。在这个实验中逆转录时的引物可以直接用荧光定量PCR的引物吗？还是

有什么特殊的要求呢？

A：如果是两步法做的话，反转录通常用的是随机引物或者oligoT,这样当然是无法用于PCR

步骤的，需要重新选定基因特异性引物。为了避免RNA中有DNA染色体污染的的问题，

在反转录以前最后做DNa处理，或者在设计PCR引物时，让上下游引物处于不同的外

显子上（跨越内含子）

做逆转录时的基因特异引物只要扩出的条带无杂带，特异性强，扩增产物长度在150-300bp

之内就可以用于荧光定量PCR。

Q：1.“随机引物”是什么意思，自己如何设计呢？

2.“oligoT”是不是指一段TTTTTTT……TTTTTT的引物，如果是，要多长，几个T呢？

3.逆转录出的cDNA要用于后续的实时荧光定量PCR，“随机引物”和“oligoT”各自的优缺点

都是什么？

4.“在反转录以前最后做DNa处理”，具体是怎么做的？说得详细一点，呵呵~

5.让上下游引物处于不同的外显子上（跨越内含子），这样做的目的是什么？

6.我看见园子里有人说要用“TE”调零和稀释RNA，但是我在用紫外分光光度计测定RNA浓

度时，直接用DEPC处理过的水调零和稀释RNA的。我这样做可以吗？“TE”具体是指什么

呢？

A：如果你只检测一个指标，可以用特异性引物，这样就可以避免RT-PCR过程中不同基因

转录效率不一致所造成的误差。

但是如果你要检测几个样本，你可以用oligodT或randomhexamer，不需要自己买，

RT-PCR试剂盒内有。前一段时间bio-rad工程师做Prentation时说：现在文献内做

realtimePCR的用特异性引物、oligodT和randomhexamer各占30%，剩下10%用oligo

dT+randomhexamer。如果你的引物靠近5„端，且mRNA超过3000bp，最好用random

hexamer,否则都可以。DNa一般的RNA提取试剂盒内会有。

转成cDNA后常规PCR检测RT是否成功，primer是否特异，退火温度

然后用一个样本2-10倍倍比稀释做realtimePCR，测定每对引物的efficiency。

然后检测样本，采用公式计算Ratio。现在paffle（可能拼错了）的公式比较流行。

如上所言，随机引物和oligoT都是商品化的，可以倒产品目录上看到相关信息。

oligoT只能对具有ployA的mRNA进行反转录，它和随机引物的应用在分子克隆上有论述。

DNa处理是防止提取RNA的过程中基因组DNA污染造成PCR中假阳性而采取的手段，如果

是用Qiaogen的试剂盒提取RNA，参照其说明书进行；如果是用TRIZOL提前，在正常提取

完成后，将溶解好的RNA样品按照DNa的说明书进行操作。

跨越内含子的设计目的同上，如果引物设计在同一个外显子上，有cDNA和污染的基因组为

模版获得的PCR产物无法区分，如果引物设计在不同外显子上，以cDNA为模版扩增的目的

产物比较小（因为mRNA上内含子被切除了），且扩增效率较高，而以污染的基因组DNA为

模版的PCR获得的产物要大一些（因为包括内含子序列），扩增效率会低，甚至扩增不出来。

据说TE在紫外上信号相对稳定，其配方见分子克隆。

Q：我是按照两步法做逆转率荧光定量PCR。现在已经买到RT试剂盒了，马上要开始做逆

转录这一步。试剂盒的东西还是很全的，里面有三种引物：oligoT，随机引物，对照引物。

我的样本RNA是用Trizol提的，是不是在逆转录以前必须要用DNA酶处理所提的RNA？

我听有人说，可能是DNA酶本身的因素，用DNA酶处理RNA也会引起RNA降解的危险。

如果我用Trizol提出RNA，不做DNA酶处理这一步骤，而是直接逆转录，然后设计跨越内

含子的PCR引物进行荧光定量PCR。这样的做法可取吗？

A：我们试验室也不做dna酶处理这一步，直接反转录，可以将荧光定量的引物设在两个外

显子上，这样就会避免有dna的污染产生杂带，还有更可靠的是将上下游都引物设在外显

子的交接处，但是很少有序列能这样设出来。

Q：听说做荧光定量PCR用到的材料和普通PCR的差不多，只是多了染料，是这样吗？还

有，就RNA的质和量而言，做荧光定量PCR比做普通PCR要求更高吗？具体高在那些地

方呢？

我这几天也从组织提了RNA，然后做了RT。我对RNA和RT的产物都做了电泳，但是不

知道自己的实验结果好不好，麻烦大家帮我看看存在什么问题。下面是RNA电泳图片：

下面这张是RT产物的电泳图片：

A：1）取决于定量PCR的方法，如果用SYBRGREEN，基本上来说就是只是多了荧光燃

料而已，如果是用Taqman等方法，那么就是要又标记了荧光的探针。

2）PCR产物大小一般是有差异的，普通RT各种大小都有，不过我们通常不想片断太小，

以免跑胶不变，在做定量的时候，为了扩增效率的问题，一般产物大小在100bp上下。

3）我不认为对RNA的质和量的要求其实不是取决于技术，而是取决于实验目的。通常情

况下，普通PCR你只想知道阴性和阳性，所有RNA质量差一点无妨，质量不好的RNA定

量PCR也能出来，但是结果就不可靠了；灵敏度而言，定量PCR应该更高，要求的RNA

量应该不比普通的高。

4）RNA看来是有一点降解，但还是不错的；我没RT以后跑过胶。

Q：我问过我们这里做实验的好多人，他们也都不对RT产物电泳的，RT以后就直接PCR

了。有些问题想请教大家：

1、如果对RT产物进行电泳，理论上电泳图会是什么样的呢?

2、有人建议我再做实时荧定量PCR之前先做普通PCR来摸索体系的条件。还有人告诉我

说，做荧光定量PCR的引物和普通PCR的引物都不一样，如果是这样，实时荧光定量PCR

体系的条件和普通PCR的还能一样吗？应该是不相干的了。

3、我后续的实验是做荧光定量PCR，染料法或探针法应该如何选择？各有什么优缺点呢（经

济、效能、准确、简便等方面）？

A：是基本不相关了，特别是使用探针的定量PCR,通常把PCR产物控制在100bp左右了，

而用sybrgreen一般也控制在200bp上下.

探针法比较昂贵，探针设计有技巧，但是它的特异性高。

sybrgreen便宜，通用性好，但是对PRC的引物和条件要求很苛刻，因为任何合成的核酸

都会被参与定量，因此特别是引物二聚体，对此方法影响很显著。

RNA质量不是很好，ar非常明显。

如果一个标本测多个基因，建议用OligodT逆转，然后再分别realtimePCR!

如果mRNA核苷酸数过大，设计引物最好靠近3„端。还有正如版主说的跨越外显子设计引

物。

我用过fermentas的逆转试剂盒，3000多bp都没问题！

1,如果使用RandomPrimer或者Oligod(T)进行RT，产物应该是从几百到几千的smear。

2，如果是使用2步法进行RT-PCR，引物有3种选择，除了之前说的RandomPrimer和

oligod(T),还有就是GSP(genespecialprimer),如果使用GSP，前后可以使用一样的引物，

但是主要你参考一下QPCR探针设计的要求。

3，taqman的试剂相对来说比较贵，但是准确度比较高。sybrgreen有点是比较便宜，方

便。缺点是特异性不是特别高。