衍化

结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）制造及检定规程

本品系用结核杆菌经液体表面培养、蒸汽杀菌过滤除去菌

体，用沉淀分离、洗涤及再溶解的提纯方法制成的液体或冻干制

品，含有从结核杆菌培养滤液中获得的活性物质，其主要成分是

蛋白质，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的机体，能引起

特异的皮肤变态反应。用于检查结核杆菌的感染及观察免疫反

应。

1菌种

1.1菌种由中国药品生物肉制品检定所分发或经同意。

1.2制造TB-PPD用人型结核杆菌，菌号93009（H37Rv）。

菌种应有完整的历史资料，经过全面检定，冻干保存。

1.3应制备生产用菌种批，次级菌种批应控制在5代以内。

2制造

全部生产过程，包括杀死分枝杆菌，应在完全隔离的区域内

用专用设备进行。

2.1制造用培养基

使用苏通马铃薯培养基，改良苏通综合培养基，或其他适宜

培养基。培养基中应不含已知能对人或动物造成毒性和变态性反

应的成分。

2.2启开菌种（菌种批）反接种于苏通马铃薯培养基上。

置37℃培养2～3周，可在苏通马铃薯培养基上再传一代或直接

挑取苏通马铃薯管内生长良好的菌膜，移种于改良苏通综合培养

基或其他适宜培养基的表面，置37℃静止培养1～2周，供大量

接种用。

2.3大量接种

挑取发育良好的菌膜移种于改良苏通综合培养基或其他适

宜培养基的表面，置37℃静止培育8～10周。凡在培养期间或

培养终止时，有菌膜下沉、发育异常或污染杂菌者，必须废弃。

2.4杀菌

培养终止，将培养物加热，121℃30分钟进行杀菌处理。

2.5除菌

杀菌后用滤器除去菌膜及菌体，收集滤液并取样做无菌试

验，然后，加入0.3%苯酚或其他适宜的防腐剂。滤液保存在4～

8℃，但要防止冻结。

2.6提纯

用三氯乙酸和饱和硫酸铵法分别沉淀蛋白，加压过滤除去清

液，并收集沉淀物于3μm孔径的滤膜上，然后用10%氯化钠液

洗酸脱盐至中性为止，最后以磷酸盐缓冲液将沉淀物溶解，除菌

过滤后即为原液。亦可采用其他适宜方法提纯。

2.7分批

每次提纯的原液作为1亚批。最多将5个亚批混合组成为1

批。

2.8半成品检定

2.8.1物理检查

原液应为深棕色的澄明液体，不应有沉淀物或其他杂质。

2.8.2无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

2.8.3安全试验

用体重300～400g健康豚鼠2只，每只腹腔注射原液1.0ml，

观察6周，检查其症征或死亡。所有在试验后24小时内死亡的

或表现出症征的动物应作镜检，然后将有关的组织镜检和培养，

检查其有无分枝杆菌存在的证据。观察期中活存的动物也要以同

样方法检查。

如果分析杆菌活菌培养试验阴性，在观察期中全部豚鼠健康

存活，无一动物出现分枝杆菌的症征，则可判定浓缩原液通过试

验。

如果未到观察期，任何动物死于非结核病因，本试验可复试

一次。

2.8.4致敏效应试验

实验组与对照组分别用体重300～400g未做过任何试验的

健康豚鼠各3只，实验组每只豚鼠皮内注射0.1ml含

500IUTB—PPD样品，共3次，每次间隔5天，在第3次注射后

15天，实验组与对照组每只豚鼠各皮内注射0.1ml含

500IUTB—PPD样品，连续观察3天，两组动物反应不应有明显

区别。

2.8.5纯度测定

应测定蛋白（凯氏定氮法）、多糖（蒽酮法）与核酸（紫外

分光光度法）含量。蛋白含量应≥90%，多糖含量≤3%。

2.8.6效价测定

TB—PPD标准品由中国药品生物制品检定所提供。

2.8.6.1动物试验

将标准品及待检原液分别稀释马0.1ml含100IU、20IU及

4IU或其他适宜的稀释度，用体重400～600g已致敏的白色雌性

豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位，分别皮内注射

上述稀释度各0.1ml（从尾侧起先注射稀释度最高者）。于注射

后24、48小时各观察结果1次（可根据48小时的反应结果判定），

算出待检和标准TB-PPD的平均硬结反应（纵横直径相加除2）

计算累计值，并求其比值，比值1±0.2者为合格。

也可按WHO规程要求，标准品及待检样品分别稀释3个不同

的适宜稀释度，用6只致敏豚鼠，以轮圈法注射于豚鼠背部两则，

每侧3点，每点皮内注射0.1或0.2ml样品，用双盲法分别记录

24及48小时局部硬结的纵径与横径。计算每个稀释度2天的总

和（也可计算2天的平均面积），并求其比值，比值1±0.2者

为合格。

稀释度的选择应能使注射后24小时所产生的局部硬结反应

直径不小于8mm，不大于25mm，两个样品的反应直径大致相同及

两个样品的3个稀释度的剂量对数反应线应基本平行。

如待检样品效价与标准品效价不一致，可用同样方法重试一

次，并算出相当于标准品的效价进行调整，调整后再重新抽样测

定效价，直至合格。

2.8.6.2人体反应测定

动物试验合格后，应进行小量人体测定，选择对TB—PPD1IU

（好0.02μg结核蛋白）反应阳性的敏感成人最少5人或者皮内

接种卡介苗12周后免疫效果观察的婴幼儿至少20人，每人于两

前臂内侧相对部位分别注射5IU的标准品与待检样品各0.1ml，

注射后72小时观察结果，并求其比值（计算方法与2.8.6.1项

相同）。比值1±0.2，并无1例异常反应者为合格。

2.9分装冻干

经物理检查、无菌试验、安全试验、致敏效应试验、蛋白质

含量及效价测定合格后，即可根据蛋白质含量将原液进行定量稀

释至规定浓度，然后定量分装安瓿，每安瓿装量为0.5ml，分装

后立即进行冻干。每安瓿的分装误差应符合标准品的要求（差异

系数不超过1%）。

冻干后抽样做成品检定，亦可将原液保存备用。

3浓缩物检定

3.1物理检查

冻干TB—PPD应为白色疏松体，无融化迹象。加入稀释液后，

应于3分钟内全部溶解，呈棕黄色澄明液体，不得有不容物或杂

质。

如系液体原液，亦应为棕黄色澄明液体，不应有不溶物或杂

质。

3.2水分测定

冻干制品水分含量应≤3%。

3.3无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

3.4安全试验

按2.8.3项进行。

3.5纯度测定

按2.8.5项进行。

3.6致敏效应试验

按2.8.4项进行。

3.7效价测定

动物试验按2.8.6.1项进行。人体反应测定按2.8.6.2项进

行。但观察人数需增加1～2倍。

3.8保存与效期

保存于2～8℃冷暗处。冻干制品自效价测定合格之日起效

期为10年。液体原液自效价测定合格之日起效期为5年。

4TB—PPD和稀释

4.1稀释

经检定合格的浓缩物用内含0.0005%吐温80及0.3%苯酚的

pH7.2～7.4的0.01mol的磷酸盐缓冲生理盐水稀释至20IU或

50IU。

各处稀释用具应专用。加入TB—PPD后应充分摇匀，并逐瓶

抽样作无菌试验，合格后分装。

4.2分批

每次稀释的同一浓度的稀释TB—PPD为一批，同时有数瓶

者，按瓶分为亚批。

4.3分装

由专人用专用工具进行。

5成品检定

5.1物理检查

分装后应进行破漏、装量、外观检查。应为无色澄明液体，

不得有不容物或杂质。

5.2化学检查

pH值应为6.8～7.4。苯酚含量应为0.25%～0.5%。

5.3无菌试验

按《生物制品无菌试验规程》进行。

5.4防腐剂试验

用体重18～20g小白鼠2只，各皮下注射样品0.5ml，小白

鼠震颤时间不得超过半小时，观察7天，不得有局部脓肿或死亡。

5.5安全试验

每批用体重18～20g小白鼠5只，各腹腔注射样品0.5ml，

观察1周，小白鼠应健康活存。

5.6效价测定

按2.8.6.1项进行。比值1±0.2者为合格。

6保存与效期

保存于2～8℃暗处。自稀释检定合格之日起效期为1年。

50IU/ml结核菌素纯蛋白衍化物（TB-PPD）使用说明书

本品为每ml含50IU结核菌素纯蛋白衍化物（TB—PPD）的

稀释制剂，经与国家标准品标准，达到完全一致。专供结核病的

临床诊断，卡介苗接种对象的选择及卡介苗接种后质量监测用。

本品为无色澄明液体，含苯酚防腐剂，不得有不溶物或杂质。

对象

婴儿、儿童及成人均可使用。

用法

吸取上述稀释液0.1ml（5IU），采取孟都氏法注射于前臂

掌侧皮内，于注射后48～72小时检查注射部位反应。测量应以

硬结的横径及其垂直径的mm数记录之。反应平均直径≥5mm为

阳性反应。凡有水泡、坏死、淋巴管炎者均属强阳性反应，应详

细注明。

禁忌

患急性传染病（如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎等），

急性眼结合摸炎，急性中耳炎，广泛性皮肤病者暂不宜使用。

注射事项

1.注射器及针头应当专用，不可作任何其他注射之用。

2.安瓿有裂纹、制品内有异物者不可使用。

保存

本品为已稀释制品，于2～8℃保存，效期为1年。