ddh2o

实验方法与步骤

1表达质粒的构建及测序分析

1.1cofilin-1的片段的准备

1.1.1引物设计

根据在GenBank上查找人源cofilin-1的基因序列，用PrimerPremier5.0软

件进行上下游引物的设计，并送往上海生物工程技术服务有限公司合成的PCR

引物。引物如下：

引物名称序列

F-cofilin-15′-AAGTCGACATATGGCCTCCGGTGTG-3′

R-cofilin-15′-TCTCTCGAGGGCTCACAAAGGCTTG-3′

将以上引物用灭菌的三蒸水稀释成10μmol/L，分装于Eppendorf管中，-20℃

冰箱中保存备用。

1.1.2cofilin-1片段PCR

1反应体系：

KODpolymera(3’-5’核酸外

切酶活性)

2.5μl

KODpolymerabuffer5μl

MgSO42.5μl

DMSO（“万能溶剂”）

2.5μl

dNTPMixture5μl

PrimerF（底物）

1.5μl

PrimerR1.5μl

Template（模板）

5μl

ddH2O25μl

Total50μl

2PCR反应条件：

①94℃预变性

3min

②94℃退火

30s

③65℃延伸

40s

④68℃

40s

⑤goto②30个循环

⑥68℃

5min

⑦4℃

forever

3琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测

（1）配置浓度为1%的凝胶。称取琼脂糖0.3g，加入30ml1×TAE电泳缓冲液

（Tris-乙酸电泳缓冲液）中，用微波炉加热2min，待凝胶稍冷却，加入2μlEB（溴

化乙锭，荧光染色剂）混匀后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，并用玻璃棒驱除气泡，

待凝胶完全凝结后拔除梳子。

（2）把凝胶置于1×TAE电泳缓冲液的电泳槽中，加样孔置于负极一侧，然后

依次在加样孔中加入50μlMarker、50μl样品＋10μlloadingbuffer(上样缓冲液，可

以显示两条带，前面的蓝色的条带是溴酚蓝，代表的片段大小是300bp，后面的

有点绿色的条带是二甲苯青，代表的片段大小在4000bp左右)，盖上电泳盖，以

100V电压进行电泳。

（3）当Marker条带充分分开后即可停止电泳，将凝胶移至保鲜膜上，置于凝

胶自动成像仪中分析。

4割胶回收PCR反应体系的扩增产物，用OmegaBio-Tek公司的GelExtrection

Kit进行回收：

（1）将PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下迅速切取含有目

的条带的琼脂糖凝胶，放入灭菌的EP管中。DNA在紫外灯下曝光时间不超过30s。

（2）称量凝胶块重量，以1g＝1ml进行计算，加入适量体积的bindingbuffer，

55-65℃加热至凝胶完全融化（约7～10min），每隔2～3min震荡一次。

（3）将HibindDNA柱子套在2ml的收集管。将上述步骤（2）的溶液转移至

HibindDNA柱子中，10000×g离心1min，弃滤液。

（4）将柱子装回收集管中，加入300μlbindingbuffer，10000×g离心1min，

弃滤液。

（5）将柱子装回收集管中，加入700μlSPWwashbuffer，10000×g离心1min，

弃滤液。

（6）重复步骤（5）一次。

（7）弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

（8）将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的

65℃预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2min，洗脱DNA。

1.2表达载体pET-28a质粒的抽提

接种含pET-28a的大肠杆菌DH5α，37℃培养过夜。质粒抽提采用Omega

Bio-Tek公司的PlasmidMiniKitI进行质粒小抽：

1取－20℃冰箱中保存的含pET-28a质粒的DH5α菌种50μl接种于4ml的LB培养

基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养12h。划平板，活化菌种，置

于37℃恒温箱中培养过夜，挑单菌落接种于4ml的LB培养基（含卡那霉素

100μg/ml）中（培养基中加卡那霉素抑制杂菌和不含目的基因的菌），37℃，180rpm

培养12h。

2加入200μlGPSbuffer（硅胶柱平衡缓冲液，减少柱子中硅胶模的憎水基团，

有利于结合核酸）于柱子中，室温放置2min，10000×g离心2min，弃去掉收集管

中的废液，柱子平衡完毕。

3将菌液移至灭菌的EP管中，室温下，10000×g离心1min，彻底去除上清，收

集沉淀菌体。

4加入200μlSolutionI/RNaA混合液，浮涡旋震荡使细菌充分悬浮。

5往重悬液中加入200μlSolutionⅡ，轻轻颠倒EP管4-6次，使细菌裂解，室温

放置2min，至溶液变成澄清。

6加入300μlSolutionⅢ，温和颠倒数次，至溶液出现白色絮状沉淀。室温下，

10000×g离心10min。

7取出平衡后的柱子置于收集管上，将步骤6中的上清全部转移到柱子里。室温

下，10000×g离心1min，弃滤液。

8将柱子装回收集管中，加入500μlHiBindbuffer。室温下，10000×g离心1min，

弃滤液。

9将柱子装回收集管中，加入700μlWashSolution。室温下，10000×g离心1min。

重复该步骤一次。

10重复步骤9一次。

11弃滤液，将柱子装回收集管中，13000×g离心1min，以甩干柱子。

12将柱子安置于灭菌的1.5ml的离心管上，在柱子中央处加入30～50μl的65℃

预热的灭菌ddH2O，室温放置2min。13000×g离心2mi。

跑1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒抽提纯度。-20℃冰箱中保存备用。

1.3cofilin-1片段和表达载体的双酶切

用NdeI和XhoI分别酶切PCR产物cofilin-1cDNA和表达载体pET-28a，37℃水

浴反应4h，反应体系如下：

表达载体酶切体系：PCR产物酶切体系：

表达载体

15μl

cofilin-1片段

10μl

10×HBuffer（Ｌ

ＭＨＫＴ代表缓

冲液中盐浓度或

成分不同）

92μl10×HBuffer2μl

XhoI1μlXhoI1μl

NdeI1μlNdeI1μl

ddH2O1μlddH2O6μl

Total20μlTotal20μl

1.4酶切产物的回收

酶切产物分别进行1%琼脂糖凝胶电泳后，胶回收酶切产物。步骤同PCR反

应产物胶回收。

1.5连接反应

将PCR产物cofilin-1cDNA的酶切回收产物和表达载体pET-28a的酶切回收

产物于16℃连接24h，反应体系如下：

cofilin-1cDNA酶切回收产物

18μl

pET-28a酶切回收产物

6μl

10×T4DNAligabuffer3μl

T4连接酶

3μl

Total30μl

1.6感受态大肠杆菌DH5α的制备（将快速生长的大肠杆菌置于经低温预处

理的低渗CaCl2溶液中，会造成细胞膨胀，诱导细胞成为感受态，细胞通透性发

生改变，在短暂的热刺激后，细胞膜出现许多间隙，外源DNA被细胞吸收，通

过复制，表达，实现遗传信息的转移，将转化后的细胞在选择性培养基上培养，

筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆）

1于-20℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌种，于LB固体培养基上划平板，

置于37℃恒温箱中培养过夜。挑单菌落，接种试管4mlLB培养基中，37℃，

180rpm培养12h。

2将试管中的菌液按1%的接种量接种到含50mlLB培养基的锥形瓶中，37℃，

180rpm，培养2-3h，当OD600=0.3~0.5时，停止摇菌。

3将锥形瓶中的菌液分别倒入两个已灭菌的50ml离心管中，于冰上放置10min

左右。

44℃，4100rpm离心10min，于超净台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。

5加入20ml预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，4℃，4100rpm离心10min，于超净

台里弃去上清，离心管倒滤纸上吸干。

6加入2ml预冷的0.1mol/LCaCl2重悬菌体，加甘油至终浓度为15%，分装于

1.5mlEP管中，转移-80℃保存备用。

1.7连接产物的转化

1将感受态大肠杆菌从-80℃冰箱中取出后，立即放在冰上，让其慢慢融化。

2将16μl连接产物加入100μL感受态大肠杆菌中，轻轻混匀，冰浴30min。

3将Eppendorf管放入42℃水浴箱中热冲击90s，再迅速冰浴1-2min。

4于EP管中加入400μlLB培养基，置于摇床上，37℃，50rpm培养45min。

5将转化后的菌液涂于LB固体培养基上(含卡那霉素20μg)，置于37℃恒温培养

箱中倒置培养过夜。

1.8双酶切鉴定重组子

1.8.1双酶切鉴定和PCR鉴定

1从接有重组菌落的平板中挑取单菌，落接种于4mlLB培养基（含卡那霉素

100μg/ml）的试管中，37℃，180rpm培养12h，OMEGA质粒抽提试剂盒抽提质

粒。

3限制性内切酶NdeI和XhoI酶切转化子质粒，将反应物置于37℃水浴箱中水浴

4h。反应体系如下：

质粒pET28a-cofilin-1

1μl

10×HBuffer1μl

XhoI1μl

NdeI1μl

ddH2O6μl

Total10μl

4电泳分析。将酶切产物、抽提出的未经酶切的质粒和PCR鉴定的反应产物一

起进行琼脂糖凝胶电泳分析

1.8.2重组子的序列分析

挑选经双酶切鉴定和PCR鉴定呈阳性的含重组子的菌落，接种到4mlLB培养

基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃、180rpm过夜12h，15％甘油保种（甘油有

隔绝空气，衡湿，调节渗透压，并在冷冻过程中起冷冻保护剂的作用）。并送样

品英骏公司测序。

2cofilin-1在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达

2.1感受态大肠杆菌BL21(DE3)的制备

具体方法和步骤同1.6。

2.2重组质粒pET28a-cofilin-1转化BL21大肠肝菌感受态细胞

取鉴定正确的重组质粒pET-28a-cofilin-1转化入感受态的大肠杆菌

BL21(DE3)，具体方法和步骤同1.7。于LB固体培养基（含卡那霉素20μg）上划

平板，并筛选阳性单克隆。

2.3cofilin-1的诱导表达

挑单菌落，接种于4mlLB培养基（含卡那霉素100μg/ml）中，37℃，180rpm

培养至OD600=0.8～1.0。取1ml作未诱导对照，其余加IPTG（异丙基硫代半乳糖

苷，是一种极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，诱导β-半乳糖苷酶活性，

在平板中加入IPTG，可以根据是否呈现白色菌落或噬菌斑而方便挑选出基因重

组体）至终浓度1mmol/L，在37℃下诱导4h。

2.4cofilin-1的鉴定

2.4.1SDS-PAGE电泳检测

1电泳样品制备。离心收集诱导后的菌体，将菌体沉淀重悬100μlddH

2

O中，

并加入2×SDS-PAGEloadingbuffer混匀，100℃加热10min，4℃保存备用。

上样量（μl）=270/（菌体OD600×浓缩系数）；（浓缩系数=菌液体积/样品

体积）

2电泳样品制备及凝胶的灌制。12%SDS-PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：

成分分离胶(ml)浓缩胶(ml)

30%丙烯酰胺溶液

40.67

ddH2O3.22.7

1.5MTris-Cl(pH8.8)2--

0.5MTris-Cl(pH6.8)--0.5

10%SDS0.010.04

10%APS0.010.06

TEMED0.0050.002

按照BIO-RAD公司蛋白质电泳的操作说明书安装好凝胶板。配置12％

SDS-PAGE分离胶，混匀后迅速灌胶，留出灌注浓缩胶所需空间（约1.5cm）。

加水覆盖浓缩胶至玻璃板的边缘，室温下垂直放置30min。待分离胶完全凝固后，

吸走用于覆盖的水。配置4％的浓缩胶，在已凝固的分离胶上灌入浓缩胶，立即

向浓缩胶溶液中插入上样梳子，小心避免混入气泡，室温下垂直放置30min。

3SDS-PAGE电泳。待浓缩胶完全凝固之后，取下并固定于电泳槽中，槽内加

入新配的1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，小心拔出上样梳子，按顺序加样。向槽外加

入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液后，即可连接电源，以恒压方式进行电泳。电泳条件：

室温下，浓缩胶恒压50V，分离胶恒压100V，电泳时间约为2h，待溴酚蓝到达分

离胶底部，即可停止电泳。

4染色。从电泳装置取出凝胶板，卸下玻璃板得到的凝胶切去浓缩胶，用蒸馏

水清洗凝胶表面的缓冲液。室温下，用染色液浸泡染色，在摇床上温和振动4h

以上。

5脱色。回收染色液，加入脱色液。室温下，在摇床上温和振动，直至凝胶背

景颜色变浅，其间更换脱色液3次。

2.4.2Westernblotting鉴定

1以2.3.2中的方法进行菌体总蛋白SDS-PAGE电泳。

2前期处理。根据点样孔的位置及蛋白mark的标记，切下需进行Westernblotting

检测的凝胶条带，测量并记录被切下凝胶的长与宽，将凝胶置于电转缓冲液中浸

泡。剪6张滤纸和1张PVDF膜，大小与凝胶相同。滤纸浸入预冷的电转缓冲液，

PVDF膜先用甲醇活化5min，再浸入预冷的电转缓冲液5min以上，需除去沾在膜

上的气泡。

3转膜。按如下顺序放置湿转仪：阴极（黑面）—海绵—3张滤纸—凝胶—PVDF

膜—3张滤纸—海绵—阳极（白面）。每层需从左到右铺上，铺好后在其上面加

小量预冷的电转缓冲液，在用试管从左到右滑动以排去叠层中可能残留的气泡。

电转条件：4℃，100mA恒流转膜1h。

4封闭。从电转装置取下PVDF膜，剪下一角作为标记。用TBST清洗PVDF膜的

表面，加入适量封闭液，室温下，在摇床上温和振动，封闭1h。

5一抗体和目的蛋白的结合。取出PVDF膜，用TBST清洗PVDF膜的表面，放入

杂交袋，加适量1:3000稀释的一抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，4℃过夜。

取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。

6二抗体和一抗体的结合。将膜放入杂交袋内，加适量稀释后的辣根过氧化物

酶标记的二抗稀释液，尽可能排除气泡，封口，室温下，在摇床上温和振动1h。

取出PVDF膜，用TBST漂洗3次，每次5min。

6显影。取出PVDF膜，用滤纸小心吸干膜上的液体。将ECL液加入Eppendorf

管内混匀，滴加在PVDF膜上，充分接触后，用滤纸小心吸干膜上的多余的液体，

用保鲜膜包好。暗室中，加X光片（剪下一角以作标记）压片曝光，洗片顺序：

显影液—自来水—定影液—自来水。X光片晾干后，分析结果。

2.4重组菌的生长曲线

1接种50μl重组菌到4mlLB培养基（含卡那霉素100μg/ml）的试管中，在培养

箱中，37℃，180rpm培养12h。

2转接1.5ml试管中的菌液到含50mlLB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉素

100μg/ml）中（如果转化并连接成功的大肠杆菌具有抗氨苄能力），在培养箱中，

37℃，180rpm培养。

3以接种前的LB培养基为空白，测定接种后菌液的OD

600

，每隔1h取样一次，

以OD

600

和重组菌生长时间绘制生长曲线。

2.5最佳表达条件的筛选

2.5.1诱导剂IPTG的用量的筛选

1将重组菌以3%的接种量分别转接至含50mlLB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉

素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。

2待OD

600

约等于0.6～0.8时，分别加入IPTG至终浓度为0mmol/L、0.2mmol/L、

0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.5mmol/L、2.0mmol/L。37℃，

180rpm培养4h。

3诱导4h后，取样测定菌液OD

600

，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌

体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪

的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1

蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导剂IPTG的用量。

2.5.2诱导温度的筛选

1将重组菌以3%的接种量分别转接至含50mlLB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉

素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。

2根据2.5.1的结果选取合适的IPTG浓度，待OD

600

约等于0.6～0.8时，加入IPTG

后，分别于20℃、25℃、30℃、37℃进行诱导。180rpm培养8h。

3诱导8h后，取样测定菌液OD

600

，同时取出1ml菌液样品，如步骤2.4.1进行菌

体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪

的软件进行光密度扫描分析，确定重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1

蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比例最高的为诱导温度。

2.5.3诱导时间的筛选

1将重组菌以3%的接种量分别转接至含50mlLB培养基的锥形瓶（含氨苄青霉

素100μg/ml）中，37℃，180rpm培养。

2根据2.5.1和2.5.2的结果选取合适的IPTG浓度和诱导温度，待OD

600

约等于

0.6～0.8时，加入IPTG后，分别于4h、8h、10h、12h、16h、20h、24h取样测定

菌液OD

600

，同时取出1ml菌液，样品经处理后，置4℃保存备用。

3待样品收集完成后，如步骤2.4.1进行菌体总蛋白的SDS-PAGE电泳，检测

cofilin-1蛋白的表达。电泳结果用凝胶成像仪的软件进行光密度扫描分析，确定

重组蛋白在总蛋白中的含量，并选取cofilin-1蛋白表达量在菌体总蛋白中所占比

例最高的为诱导时间。

3cofilin-1蛋白纯化与鉴定

3.1菌体裂解上清的制备

1称量菌体湿重，以1：10的比例加入PBS（pH7.8）缓冲液（磷酸缓冲液），

涡旋震荡使菌体重悬，直到没有菌块存在。

2在冰浴条件下，超声破碎菌液，参数功率条件：800W；超声时间3s；间歇时

间6s；超声循环99次，超声次数：2～3次。

34℃，17000×g离心30min，分别收集收集上清和沉淀。

4如步骤2.4.1进行SDS-PAGE电泳检测。

3.2cofilin-1重组蛋白的纯化

1镍琼脂糖凝胶（固定金属离子亲和色谱，利用蛋白质表面的氨基酸，如组氨

酸与多种过渡金属Cu，Zn,Ni,Co,Fe发生特殊的相互作用，利用这个原理把富含

这类氨基酸的蛋白质分离出来）预处理。取出镍琼脂糖凝胶8g，放入蒸馏水中充

分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定于滴定架上，使

镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.8）冲洗。

2层析柱平衡。用100～200ml0.5mol/LNaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用

蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100～200ml0.1mol/LEDTA（络合剂，和

碱金属，稀土元素和过渡金属形成稳定的水溶性络合物）缓冲液平衡柱子，静置

30min，蒸馏水冲洗。处理完后，将镍琼脂糖凝胶浸泡于0.5mol/L硫酸镍中过夜。

控制流速1ml/min。

3加样及洗脱穿透峰1。用PBS（pH7.8）将多余的硫酸镍冲洗下来，待流出液

的吸光值不再变化时，加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.8）

洗脱。控制流速1ml/min，检测波长为280nm，收集洗脱峰。

4洗脱杂蛋白峰2。待流出液的吸光值不再变化时，用30mM/L咪唑的缓冲液洗

脱杂蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。留样电泳，收集洗脱峰。

5洗脱目的蛋白峰3。待流出液的吸光值不再变化时，用300mM/L咪唑的缓冲液

洗脱cofilin-1重组蛋白，流速为2ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。

6层析柱再生。用0.5molNaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗

100ml，流速为2ml/min，放置4℃冰箱保存。

7SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检

测。

3.3cofilin-1重组蛋白脱咪唑（咪唑能竞争性的结合到柱子上，使带His标签

的目的蛋白丧失了结合位点，从而被洗脱下来）

1ephadexG-25（交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、

G-100、G-150、和G-200。G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克）预处理。取出

ephadexG-25约30g，放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将

层析柱装好垂直固定于滴定架上，使镍琼脂糖凝胶沿玻璃棒倒入柱内，并用超纯

水冲洗。

2层析柱平衡。用300ml超纯水冲洗，控制流速1ml/min，检测波长为280nm，。

3待流出液的吸光值不再变化时，将3.2制备的cofilin-1重组蛋白上样，流速为

3ml/min。

4用超纯水1洗脱，流速为3ml/min，检测波长为280nm。收集洗脱峰。当蛋白

峰下降时，每隔1min收集少量液体加入20μl的硝酸银混匀，当出现白色沉淀时，

停止收集溶液。

5层析柱再生。用0.5mol/LNaOH和纯水各流洗200ml，再用20%的乙醇流洗

100ml，流速为2ml/min，放置4℃冰箱保存。

6SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检

测。

7将脱咪唑后的蛋白溶液置于-20℃过夜，待溶液结冰后，放入冷冻干燥机中冻

干成粉末，收集后放-20℃保存。

3.4cofilin-1重组蛋白分子量的测定

cofilin-1蛋白送暨南大学生命与健康工程研究院用基质辅助激光解吸/电离

飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）测定其精确分子量。

4cofilin-1重组蛋白生物活性的检测

4.1样品前处理

称取粉末状的cofilin-1重组蛋白及actin蛋白（即“肌动蛋白”，β-Actin是PCR

常用的内参，β-Actin抗体是WesternBlot很好的内参指数）分别溶于适量的双蒸

水中，充分溶解。置于冰上待用。

4.2BCA法测定蛋白浓度

BCA法原理是：在碱性的条件下，二价铜离子可以被蛋白质还原成一价铜

离子，BCA与一价铜离子结合形成稳定的紫蓝色复合物，该水溶性的复合物在

562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度有正比关系。

（1）BSA标准曲线的制备。

准备8个1.5mLEP管，按照下面配制浓度分别为0μg/μl、0.025μg/μl、0.05μg/μl、

0.1μg/μl、0.2μg/μl、0.3μg/μl、0.4μg/μl、0.5μg/μl的BSA标准溶液。

编号

12345678

(0.5mg/ml)

BSA(μl)

6008001000

PBS（μl）

Totalvolume

（μl）

10001000

（2）蛋白样品的处理。

将蛋白样品用PBS稀释后，涡旋混匀后，加入96孔板，每个样品3个复孔，

每个孔加入10μl。将BCA试剂按比例混合后，每个孔加入100μl。37℃放置30min。

用酶标仪检测，波长为570nm。

4.3非变性PAGE电泳检测

1准备Eppendorf管标记编号1～9。将样品分别加入EP管中，actin蛋白溶液向1～

9管每管分别加入20μmol/L；DNaI蛋白溶液向2～9管每管分别加入16μmol/L；

cofilin-1蛋白溶液向3～9管每管分别加入5μmol/L、10μmol/L、12.5μmol/L、

15μmol/L、20μmol/L、25μmol/L、30μmol/L。最后每管分别加入8×G-buffer和

双蒸水，使终浓度为1×G-buffer，终体积为16μl，充分混匀，整过程在冰上进行。

2将Eppendorf管放入22℃水浴箱中，反应20min。

3取出Eppendorf管置于冰上，加入5×非变性PAGEloadingbuffer混匀。

410%非变性PAGE蛋白电泳胶配制成分如下：

成分分离胶(ml)浓缩胶(ml)

30%丙烯酰胺溶液

3.330.53

ddH2O3,872.93

1.5MTris-Cl(pH8.8)2.5--

0.5MTris-Cl(pH6.8)--0.5

10%APS0.010.06

TEMED0.0040.006

5如步骤2.4.1进行非变性PAGE蛋白电泳。电泳条件：4℃，浓缩胶恒压30V，

分离胶恒压70V，电泳时间约为5h，待溴酚蓝到达分离胶底部，即可停止电泳。

5cofilin-1重组蛋白多克隆抗体的制备

5.1动物免疫步骤

1样品的处理。将冻干的粉末状的cofilin-1重组蛋白溶解于PBS中，终浓度为

1mg/mL，用0.2μm的滤器过滤除菌。把除菌后的cofilin-1重组蛋白溶液与弗氏完

全佐剂以1：1完全混合制备成（"油包水"乳状液，能够非常有效的诱导产生高

浓度的抗体。弗氏完全佐剂含结核分枝杆菌的细胞壁成分，用于初次免疫刺激。）。

cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml。

2初次免疫。准备家兔4只，取免疫前血清为阴性对照组，向家兔背部的皮下多

点注射cofilin-1与弗氏完全佐剂的混合物，共注射1ml。

3加强免疫。每隔10天，进行臀部的皮下多点注射cofilin-1与弗氏不完全佐剂（不

完全佐剂是油剂（石蜡油或植物油）与乳化剂（羊毛脂或吐温（Tween）80）相

混合而成。在不完全佐剂中加入死的分枝杆菌，即成为费氏完全佐剂。就是刺激

机体产生免疫应答）的混合物，cofilin-1混合物终浓度浓度为0.5mg/ml，共注射

1ml。第三次免疫后10天，耳动脉抽血，4℃过夜，第二天离心分离血清，ELISA

法检测抗血清的效价。当效价合格后，便可停止免疫，否则继续加强免疫。

4抗血清初步处理。抗血清效价达到要求后，剪断兔的颈动脉采血，所采集的

血液在室温下放置2h左右，再放置4℃过夜，第二天4000×g离心4min收集抗血清，

抗血清分装后放-20℃冰箱保存。

5.2ELASA检测抗血清的效价

1包被。用包被缓冲液（一般Elisa包被用的缓冲液都是偏碱性的碳酸盐缓冲液

（pH8-9)，目的就是要让被包被的蛋白质暴露较多的阴性集团，更稳定的吸附到

板子上。）稀释cofilin-1粉末，至终浓度为1μg/mL。将溶液加入酶标板内，每孔

100μl，4℃过夜。

2洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

3封闭。每孔加入封闭液100μl，37℃放置2h。

4洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

5一抗与蛋白的结合反应。将抗血清用稀释液稀释成1:2000、1:4000、1:8000、

1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000，每孔100μL，每个浓度设置2

个复孔，37℃放置2小时。

6洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

7酶标抗体反应。用稀释液将HRP标记的羊抗兔IgG-按1:3000稀释，每孔100μL，

37℃保温2小时。

8洗涤。将酶标板中液体甩干，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

9显色.。加100μlTMB，37℃避光放置15min，加入50μl2mol/LH2SO4终止显

色。利用酶标仪检测结果。使用条件：波长为450nm，参比波长为630nm读数。

多克隆抗体的效价公式：阴性对照OD值记为N，免疫后抗血清OD值记为P，

若P/N≧2.1，且P-N>0.2，即判为阳性结果，以出现阳性反应的最高稀释度作为

抗体的效价。

5.3cofilin-1抗体的纯化与检测

5.3.1盐析操作步骤

1取15ml的抗cofilin-1兔血清与15ml生理盐水充分混合。向混合液慢慢滴加饱和

硫酸铵30ml（硫酸铵饱和度为50%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3

小时以上，使其充分沉淀。

23000rpm离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫

酸铵20ml（硫酸铵饱和度为40%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3

小时以上，使其充分沉淀。

33000rpm离心20min，弃上清，以生理盐水溶解沉淀至30ml，慢慢滴加饱和硫

酸铵14.7ml（硫酸铵饱和度为33%），并不断搅拌至百色浑浊物出现，4℃放置3

小时以上，使其充分沉淀。

43000rpm离心20min，弃上清，将所得沉淀物以的PBS(pH7.4)溶解至15ml。

5将溶液分装到超滤离心管，3000rpm离心20min，弃离心管下层滤液，向上层

溶液再加入PBS混合。

6重复步骤5多次，将脱盐后的蛋白溶液置于4℃保存备用。

5.3.2DEAE离子交换层析

1DEAE-SephadexA-50预处理。取出DEAE-SephadexA-50（以下简称A-50）8g，

放入蒸馏水中充分搅拌清洗，静置2h后倾去上层蒸馏水。将层析柱装好垂直固定

于滴定架上，A-50沿玻璃棒倒入柱内，并用PBS（pH7.4）冲洗。

2层析柱平衡。用100～200ml0.5mol/LNaOH缓冲液平衡柱子，静置30min，用

蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；再用100～200ml0.5mol/LHCl缓冲液平衡柱子，

静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性；用100～200ml0.5mol/LNaOH缓

冲液平衡柱子，静置30min，用蒸馏水冲洗至流出液pH呈中性。处理完后，将A-50

浸泡于PBS（pH7.4）中过夜。控制流速1ml/min。

3加样及洗脱。向层析柱内加入PBS（pH7.4），待流出液的吸光值不再变化时，

加入样品，待样品液面与柱面相切时，再加入PBS（pH7.4）洗脱。控制流速

1ml/min，检测波长为280nm。。

4收集样品。在开始洗脱的同时就以试管分部收集样品。

5层析柱再生。用NaCl洗脱蛋白质，待流出液的吸光值不再变化时，再以蒸馏

水洗去柱中盐。然后按层析柱平衡的过程将A-50再处理一遍。用无水酒精洗2次，

放置4℃冰箱保存。

6SDS-PAGE电泳。以2.3.2中的方法对纯化中收集的样品进行SDS-PAGE电泳检

测。

5.4纯化抗体的检测

5.4.1纯化抗体效价的测定

以5.2中的方法对纯化后抗体的效价进行ELASA检测。

5.4.2westernblotting鉴定多克隆抗体的特异性

1细胞总蛋白的提取

用胰酶分别消化MEF和Atg细胞，室温下，放置1～2min。观察中方瓶底部

起白色雾状时，将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。加入6ml的培养

液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮，吸出3ml分装到另一中方瓶，再加入3ml

培养液混匀，放培养箱内，37℃培养2天，待瓶内细胞长满后，即可进行以下操

作：

（1）用胰酶消化细胞，室温下，放置1～2min。

（2）将消化液倒掉，用吸管将未倒净的消化液洗掉。

（3）加入6ml的培养液，用吸管轻轻吹打使细胞充分悬浮。

（4）将悬浮细胞液转移到15ml离心管内，室温下，3000rpm离心5min。

（5）取出离心管，倒掉培养液，倒置在滤纸上，吸尽培养液。

（6）加入1mlPBS，涡旋混匀，室温下，3000rpm离心5min。

（7）倒掉PBS，倒置在滤纸上，吸尽PBS。

（8）加入60μlPIPA裂解液（含2%的PMSF），立即置于冰上，裂解30min，每5min

涡旋混匀，混匀后立即置于冰上。4℃，12000rpm离心15min

（9）取上清置于Eppendorf管中，-20℃保存备用。

2westernblotting具体操作步骤参照2.4.2