不定芽

马兜铃不含腋芽茎段不定芽的诱导

宋运贤;张强;杜雪玲;彭贺;唐润;张园园;陈耀锋

【摘要】为建立马兜铃()不含腋芽茎段的不定

芽诱导体系，采用正交设计方法研究植物生长调节剂、预培养方式和AgNO3对

不定芽诱导的影响。结果表明：植物生长调节物质对不定芽诱导的影响以TDZ>6-

BA>IAA，其中TDZ的影响极显著(P<0.01)，6-BA的影响显著(P<0.05)。不定芽

诱导的最适培养基为MS+0.5mgL-1TDZ+0.1mgL-1IAA+0.5mgL-16-

BA+2mgL-1AgNO3+3%蔗糖+0.6%琼脂(pH5.8)；预培养方式为在MS+0.1

mgL-12,4-D+3%蔗糖+0.6%琼脂培养基上暗培养2d。马兜铃不含腋芽茎段的

不定芽诱导率最高可达37.5%。%Inordertoestablishadventitiousbud

inductionsystemfromstemgmentswithoutaxillarybudofAristolochia

,theeffectsofplantgrowthregulators,pre-culture

patternandAgNO3ontheinductionratewerestudiedbyusing

ultsshowedthattheeffectsofplant

growthregulatorsonadventitiousbudreductionfromstemswereinthe

orderofTDZ>6-BA>IAA,inwhichTDZand6-BAhadsigniifcantinlfuence

at0.01and0.05levels,imummediumforadventitious

budinductionwasMS+0.5mgL-1TDZ+0.1mgL-1IAA+0.5mgL-16-

BA+2.0mgL-1AgNO3+3%sucro+0.6%agar(pH5.8).Aftertheexplants

werepre-culturedonMS+0.1mgL-12,4-D+3%sucro+0.6%agar(pH5.8)

indarkfor2days,andthentransferredonadventitiousbudinduction

medium,therateofadventitiousbudinductioncouldreachto37.5%.

【期刊名称】《热带亚热带植物学报》

【年(卷),期】2014(000)004

【总页数】7页(P406-412)

【关键词】马兜铃;茎段;TDZ;不定芽诱导;AgNO3

【作者】宋运贤;张强;杜雪玲;彭贺;唐润;张园园;陈耀锋

【作者单位】淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000;资源植物生物学安

徽省重点实验室，安徽淮北235000;西北农林科技大学农学院，陕西杨凌

712100;淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000;资源植物生物学安徽省

重点实验室，安徽淮北235000;淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000;

资源植物生物学安徽省重点实验室，安徽淮北235000;淮北师范大学生命科学学

院，安徽淮北235000;淮北师范大学生命科学学院，安徽淮北235000;淮北师范

大学生命科学学院，安徽淮北235000;西北农林科技大学农学院，陕西杨凌

712100

【正文语种】中文

马兜铃()为马兜铃科(Aristolochiaceae)马兜铃

属植物，其果实和根有重要的药用价值，果实的药材名是马兜铃，为清肺镇咳化痰

药；茎的药材名为天仙藤，能祛风活血；根的药材名为青木香，有解毒、利尿、理

气止痛的功效；故马兜铃又名青木香、天仙藤等[1]。然而，临床上出现的马兜铃

酸肾毒性现象和潜在的致癌作用引起了国际医药界的高度重视，因此，国家食品药

品监督管理局于2004年8月取消了青木香药用标准，凡国家药品标准处方中含有

青木香的中成药品种应替换为土木香[2–3]。但是，有研究表明，土木香在植物来

源、亲缘关系、功效主治、化学成分、药理作用和临床应用等方面与青木香有很大

差异，因此，二者不应相互替代[4]。

在明确马兜铃酸药效和作用机理的基础上运用现代基因工程手段对其进行定点改造，

以消除其肾毒性是解决这一问题的有效途径。而建立高频率的离体再生体系是遗传

转化获得成功的前提和基础。目前，国内外对马兜铃的研究主要集中于成分分析、

药理作用、肾毒性作用、栽培措施、快速繁殖等方面[3–10]，对再生体系的研究报

道主要涉及通过愈伤组织阶段的再生[11–12]，而无腋芽茎段直接诱导不定芽再生

植株还未见报道。本文以马兜铃不含腋芽的茎段为材料，通过研究不同植物生长调

节剂的配比和不同预处理方式对不定芽诱导的影响，以期建立高效的马兜铃茎段再

生体系，为开展马兜铃遗传转化的研究奠定技术基础。

1.1材料

马兜铃无菌组培苗经西北农林科技大学农学院陈耀锋教授鉴定为马兜铃科马兜铃属

马兜铃()。选取大小基本一致的马兜铃组培苗，

切取两腋芽之间的无腋芽茎段，修剪成1cm左右的长度，横放接种于培养基中。

1.2植物生长调节剂的影响

采用正交设计，研究6-BA、IAA和TDZ对马兜铃茎段不定芽诱导的影响(表1)。

以MS为基本培养基，所有培养基均含30gL–1蔗糖和6gL–1琼脂，pH调至

5.8。

1.3AgNO3的影响

以MS+0.5mgL–16-BA+0.1mgL–1IAA+0.5mgL–1TDZ+3%蔗糖+

0.6%琼脂为不定芽诱导培养基，分别添加0.5、2.0、5.0、10.0和20.0mgL–1

的AgNO3。

1.4预培养方式的影响

采用双因素设计研究2,4-D和黑暗预培养时间对马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导

的影响。茎段预培养以MS为基本培养基，2,4-D设置0、0.1、0.5、1.0和2.0

mgL–1共5个水平；黑暗预培养时间设置0、2、4、6和8d。诱导培养基为

MS+0.5mgL–16-BA+0.1mgL–1IAA+0.5mgL–1TDZ+3%蔗糖+0.6%

琼脂，pH5.8。

以上各种处理均重复3次，培养温度为(25±2)℃，光照强度为25μmolm–2s–1，

光照时间14hd–1。

1.5数据处理和统计

培养35d后统计不定芽诱导率。不定芽诱导率=诱导不定芽的茎段数/接种的茎段

数×100%。运用SPSS对试验数据进行方差分析，多重比较采用LSD法。

2.1植物生长调节剂的影响

将马兜铃不带腋芽的茎段接种在诱导培养基上，培养5d后茎段的两端开始膨大，

9d后在茎段伤口处开始有愈伤组织长出，15d时愈伤组织继续长大并开始变绿，

25d后茎段上开始分化出不定芽。由表1可知，植物生长调节剂对马兜铃不含腋

芽茎段的不定芽诱导率的影响以TDZ>6-BA>IAA；且在6-BA(0.5mgL–1)、

IAA(0.1mgL–1)、TDZ(0.5mgL–1)的配比下，不定芽的诱导率达22.0%。方

差分析(表2)表明：TDZ对马兜铃不含腋芽茎段的不定芽诱导率有极显著影响

(P<0.01)，6-BA有显著影响(P<0.05)，而IAA无显著影响(P>0.05)。

综上分析，马兜铃不含腋芽茎段的不定芽诱导的最适培养基为MS+0.5mgL–

16-BA+0.1mgL–1IAA+0.5mgL–1TDZ，pH调至5.8。

2.2AgNO3的影响

由表3可知，在培养基中添加不同浓度的AgNO3，马兜铃不含腋芽茎段的不定芽

诱导率不同。添加2.0mgL–1AgNO3的不定芽诱导率达到最大，为28.72%，

而不添加AgNO3的不定芽诱导率仅为14.29%，两者之间的差异显著。随着

AgNO3浓度的增加，马兜铃茎段诱导的愈伤组织也逐渐减少，在添加20.0mg

L–1AgNO3培养基中，马兜铃茎段几乎不能诱导出愈伤组织，也几乎不能诱导出

不定芽。

2.3预培养的影响

将马兜铃不含腋芽茎段先接种在含不同浓度的2,4-D培养基上，并在黑暗下预培

养一定时间。结果表明，预培养基中添加0.1mgL–12,4-D有利于不定芽的诱导

(表4，图1)，较高浓度的2,4-D(1～2mgL–1)会抑制不定芽的诱导，与对照差

异显著，甚至部分茎段还分化出不定根(图1)。黑暗预培养时间以2d为宜，时间

延长使不定芽诱导率呈下降趋势。马兜铃不含腋芽茎段在添加0.1mgL–12,4-D

培养基上黑暗预培养2d，不定芽诱导率可达37.5%。方差分析结果表明，2,4-D

和黑暗预培养时间对马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导率有极显著影响(P<0.01)。

多重比较(表5)的结果表明，预培养基中添加0.1mgL–12,4-D与对照的差异显

著，黑暗预培养2d与对照的差异显著。

建立高效的组织培养再生体系是利用遗传转化技术获得转基因植株的重要前提之一。

近年来,有关植物遗传转化的研究报道所采用的再生体系主要有原生质体再生[13]、

体细胞胚发生[14]、愈伤组织再生[10–12]和再生苗茎段、叶的器官直接发生等

[15–16]，其中通过植株的器官直接发生的途径，较前几种再生系统具有周期短、

操作简便、培养过程中发生的变异少的特点，是采用最多的再生系统。迄今为止,

建立的马兜铃再生体系多以愈伤组织为主[10–12]，由愈伤组织再生植株过程中发

生无性系变异的可能性较大，转化的外源基因稳定性较差。另外由于马兜铃叶片较

小，取出培养瓶后易脱水卷曲，不易切割培养。本试验以不含腋芽的茎段为材料建

立再生体系，具有操作简便、周期短、嵌合体相对较低、遗传稳定性高等优点。通

过初步探索，目前已初步建立了较为高效的再生体系，为后续进一步优化建立转基

因受体系统打下了良好的基础。

TDZ是一种新型的植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，可以促进植物

不定芽的再生和繁殖、打破芽的休眠、延缓植物衰老等[17]。TDZ可通过抑制叶

片的脂质过氧化作用来保护细胞膜结构的完整性、阻止叶片叶绿素的降解、延缓离

体叶片和茎段的衰老、抑制POD活性，从而提高再生效率[18]。但高浓度的TDZ

容易导致试管苗的变形、坏死、褐变，从而不利于芽或根的发生[19]。崔波等[15]

的研究表明，TDZ在火龙果(Hylocereusundulatus)茎段再生过程中起着重要的

作用，0.4mgL–1TDZ有利于植株的再生。黄芩(Scutellariabaicalensis)茎段的

诱导研究也表明，TDZ诱导不定芽的能力优于其它植物生长调节剂。本研究结果

也表明，TDZ是促进马兜铃不含腋芽茎段不定芽诱导的主要因子，较低浓度对不

定芽的诱导有很好的促进作用，随着浓度的升高，不定芽诱导率迅速下降。

Heutteman等[20]的研究表明，高浓度的TDZ促进了木本植物愈伤组织的形成。

本研究结果也表明，高浓度的TDZ会导致茎段切口边缘部位产生较多的愈伤组织，

进而降低了不定芽的诱导率。

外植体切口部位的细胞会产生大量自身保护物质乙烯。有研究指出，在组织培养中

外植体产生的高含量乙烯会引起外植体褐化死亡和植株畸形发育；Beyer认为

Ag+是一种较好的乙烯活性抑制剂[21]，对许多单子叶和双子叶植物离体形态发生

有促进作用，可以使植株再生率显著提高。Radke[22]等报道，分化培养基中添加

AgNO3，可以促进芽原基的产生和伸长。但Neidz等[23]认为AgNO3在子叶植

株再生中并无促进作用。Laurie[24]等在研究芜青子叶再生中认为低浓度

AgNO3(5.9～29.4μmolL–1)利于子叶再生，高浓度(>117.7μmolL–1)起到明

显的抑制作用[24]。本研究结果也表明：适宜浓度的AgNO3对马兜铃茎段不定芽

诱导有促进作用，与对照相比，外植体褐化现象减轻，当添加2mgL–1AgNO3

时，不定芽诱导率达到最大，而AgNO3浓度高于5mgL–1对马兜铃不含腋芽茎

段不定芽诱导有抑制作用。

牛建新等[25]指出，组织培养过程中暗培养可以促进不定芽的高效诱导，这可能是

由于IAA在光下的分解减少，从而相对提高了IAA浓度，进而刺激了不定芽的产

生。有学者认为葡萄再生需要一个暗处理过程，时间为1～4周[26]。本试验结果

也表明，适当的暗培养有助于诱导不定芽形成，最佳暗培养时间为2d，这比其他

的研究结果偏短，可能是由于物种的差异造成的。至于暗培养促进不定芽诱导的机

理还有待进一步研究。

已有研究表明，2,4-D预培养可以显著提高不定芽的诱导率，白菜型油菜(Brassica

campestris)在添加1mgL–12,4-D培养基上预培养3d,再生率由43.5%提高到

89.0%[27]。芜菁(ra)在1mgL–12,4-D的分化培养基

上预培养2d，可将不定芽再生率由81.2%提高到92.0%[28]。但李文静等[29]指

出,较高的2,4-D浓度会抑制植株再生能力。本研究结果表明，预培养基中添加

0.1mgL–12,4-D可以促进马兜铃不含腋芽茎段诱导不定芽，但2,4-D浓度达

1～2mgL–1时，不定芽诱导率明显降低，同时生根明显增加，这与前人的研究

结果一致。研究结果还表明，在高浓度2,4-D和短时间黑暗预培养，容易诱导出

不定芽；相同条件下预培养时间长则容易诱导出不定根(图1)，这为我们后继试验

中利用差异克隆方法去克隆芽、根诱导相关基因打下了基础，这也是我们下一步研

究的方向。

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