吸收的英文

人参皂苷化合物K及其丁酯和辛基酯前体药物在Caco-2细胞的

吸收机制

摘要：由于它的高极性，人参皂苷化合物K（CK）是一种口服生物利用度差的活性化合

物，而它的新型的酯前体药物，丁酸酯和辛酸酯（CK-B和CK-O），与原来的药物相比有更

强的亲脂性和良好的生物相容性。本次研究的目的是利用人体Caco-2细胞检查CK，CK-B，

以及CK-O的转运机制。结果表明在10−50μM的浓度范围内，从顶端到底端分离的（AP-BL），

CK有较的低渗透系数（8.65×10−7厘米/秒），而其脂肪酸酯CK-B（2.97×10−6厘米/秒）和

CK-O（2.84×10−6厘米/秒）的AP到BL端的通量传输速率显著大于CK。此外，经发现

CK的主要转运机制是被动的细胞扩散同时伴随介导的主动外排。此外，经发现CK-B和

CK-O不是外排转运的酶作用底物，因为外排转运的选择性抑制剂（维拉帕米和MK-571）

对CK-B和CK-O在Caco-2细胞的运输影响不大。这些结果表明，通过酰化改进CK的亲

脂性能显着提高在Caco-2细胞间的转运。

关键词：化合物K，人参皂苷，丁基和辛基酯，Caco-2细胞，肠吸收，P-糖蛋白

介绍：人参，其活性成分主要是人参皂甙，传统的东方医学中常作为本草药使用。这些人

参皂甙，属于三萜皂苷类，曾报道具有多种生物活性和药理活性，比如抗炎，中央神经系统、

心血管系统和免疫系统的抗氧化、抗衰老。以往的研究表明，人参皂甙的药理作用来源于其

经人肠内细菌生物转化的代谢产物。5−7化合物K（CK；图1）是原人参萜二醇皂苷（例如，

Rb1，Rb2钢筋混凝土）主要的药理活性代谢产物之一，据报道，它经胃肠道吸收进入血后

在肝脏中积累，一些CK被转化成可能是人体中的人参皂苷的活性成分的脂肪酸酯。8−11

许多研究显示，大多数的人参皂甙由于其高极性在人体肠道的吸收较差。odani等曾报道，

动物模型中人参皂苷Rg1的口服吸收量在剂量的1.9-20.0%范围.12其它人参皂甙比如Rb1

和Rb2消化道吸收也慢，并且大鼠的口服生物利用度相对较低。药物的生物活性不仅取决

于其化学结构，也取决于他们的亲脂性和膜渗透性，后两者可增强他们的跨细胞膜运输或影

响他们与蛋白质和酶的相互作用。

近年来，酯前体药物的发展受到了相当的关注，其被广泛用一定方法来改善整体的亲脂性、

膜渗透性和吸收较差的药物的口服吸收。15、16诺氟沙星（NFX）中的曼尼希碱和N-masked

（隐藏的）的前体药被报道可以提高其亲脂性，生物利用度和在体内的活性。17,18然而，

迄今为止，关于CK的口服吸收机制和关于酯前体药物生产以提高人参皂苷CK的口服吸收

的信息有限可得。为了提高CK的口服吸收，酯化反应提供了一个途径来获取更多的亲脂性

衍生物。此外，据报道，胆甾烷苷的酰化反应增强了抗肿瘤效力.19一些酰化的三萜皂苷从

毛果一枝黄花亚种根部分离。低浓度黄帚还可以激活的内皮细胞的代谢，从而提高血管壁的

通透性使皂苷更好的吸收进入组织。20我们由此推测，新型的CK的酯类前体药物，丁基

和辛基酯（CK-B和CK-O；图1），它们的亲脂性强于母体化合物，可能有优良的口服生物

利用度。

本研究的目的是确定CK的跨膜运输和吸收机制及其在Caco-2细胞系统中的酯衍生物。由

于其表现了与人类小肠上皮细胞在形态和功能上的相似性，Caco-2单层细胞已被公认为一

个用于预测人类肠道的药物吸收和用于肠道药物转运的机制研究的体外模型。21−23在这项

研究中，两类酯衍生物都被用于Caco-2单层细胞的跨膜运输和吸收试验中，并与CK比较，

以探讨酯化是否可以提高高亲水性的复合物的膜渗透性，从而提高药物肠吸收。

材料和方法：

材料与药品。人结肠腺癌细胞线，Caco-2细胞，是从中国科学院（上海，中国）细胞库购

买。Dulbecco改良的Eagle培养基介质（DMEM），非必需氨基酸（NEAA），青霉素−链霉

素（10000IU/毫升），汉克平衡盐溶液（HBSS），Invitrogen公司（卡尔斯巴德，CA）的胰

蛋白酶和乙二胺四乙酸（EDTA）（0.25%/0.02%）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。GIBCO

BRL（生活技术，佩斯利，英国）的胎牛血清（FBS）。西格玛奥德里奇（St.路易斯，莫）

购买的甘露醇，维拉帕米和MK-571。CK及其酯衍生物CK-B和ck-o由吉林农业大学，中

国的郑沂南博士提供。Transwell细胞培养室（孔径，0.4μ米；直径，24毫米）和ERS伏欧

表的Ag/AgCl电极均分别购自科斯特（剑桥，MA）和日本的微孔（东京，日本）。酶标仪

是由赛默飞世尔购入（ThermoScientific值MK3）。

Caco-2细胞培养。Caco-2细胞在含胎牛血清（10%，V/V），NEAA（1%，V/V），青霉

素（100U/毫升），链霉素（0.1毫克/毫升），和谷氨酰胺（0.29g/L）DMEM的培养基中培

养，放置在含5%的CO2的湿空气中37°C培养。培养基每2天更换，细胞在约90%汇合

用胰蛋白酶/EDTA溶液（0.25%/0.02%）以1—4的分流比中传代。40−60页被使用。

细胞毒性试验。CK，CK-B和CK-O对于Caco-2细胞的细胞毒性通过利用3-

（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5—苯基溴化（MTT）试验测定。24,25简单地说，0.1毫升

Caco-2细胞接种到96孔板使在96孔板的密度为每孔10，000个细胞。细胞在5%CO2、95%

相对湿度的大气中生长。孵化24小时后，加入不同浓度的测试化合物。此后，每孔加入0.2

毫升10%MTT溶液并在黑暗中培养4h。然后除去培养基，加入0.15毫升DMSO，轻轻摇

动，孵化10分钟，MTT-甲晶体被溶解，然后用酶标仪在490nm处进行吸光度的测定。未

用试验化合物培养的细胞被用作对照。在每个MTT法，每对样品进行五次重复测试。

Caco-2单层的跨膜运输实验。在运输实验中，Caco-2细胞接种到涂有密度为4×105

cells/cm2的Ⅰ型胶原的6-孔的Transwell小室上以生成Caco-2单层细胞。介质每2−3天更

换，用于实验的单层细胞留下来以区别传代后21−27天。细胞层的完整性和紧密连接的全

面发展在每个实验前通过用ERS式设备测量过滤生长的细胞单层的跨上皮电阻（TEER）来

监测。只有TEER值超过300Ω·厘米2的一个单层用于转运实验。

CK，CK-B和CK-O在Caco-2细胞单层的运输使用前面描述的方法研究，可做小的改变。

26简单说，在实验前单层用缓和的HBSS（pH值7.4，37°C）轻轻漂洗两次。细胞单层细

胞在37°C运输缓冲液中孵育30分钟。测量AP-BL渗透性，取含CK，CK-B或CK-O10−50μM

的传输缓冲液混合物0.5毫升，添加到AP侧的Transwell小室，另1.5毫升的溶液添加到

BL室。然后将该板放在37°的孵化器中。在指定的时间间隔，从BL侧收集0.4毫升等分

的溶液，并用等体积的HBSS更换。按BL-AP的方向，取含CK,CK-B或CK-O10−50μM

的传输缓冲液1.5毫升，添加到BL侧，另0.5毫升的HBSS加到AP侧。所有的孵育一式

三份进行。

对于乙烯（oxyethylenenitrilo）四乙酸（EGTA）—调制传输实验，最初的30分钟的孵育后，

用浓度为2.5mM的EGTA在37°C下，对细胞单层的AP和BL端同时预处理15分钟。细

胞膜用传输缓冲液洗三次。AP到BL端的转运以前面所述的方式开始。通过在AP和BL端

加浓度为100μM的每个抑制剂来测定mk-517和维拉帕米对CK，CK-B和CK-O通过Caco-2

膜的抑制作用。此后，根据前述方法进行转运研究。

CK，CK-B以及CK-O的细胞摄取。为了转运研究，依照描述制备细胞单层。将待测

化合物（CK，CK-B，和CK-O）上于单层细胞的AP端在37°C放置超过2小时。在选定

的时间点，收集AP和BL端的溶液，然后测定待测化合物的含量。用冰HBSS单分子膜洗

五次，用含1%TritonX-100的甲醇室温提取1小时。在10000g将细胞裂解液离心5分钟，

用高效液相色谱分析上清液。采用BCA蛋白检测试剂盒（皮尔斯，罗克福德，IL）以牛血

清白蛋白为标准测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。待测化合物的吸收表示为nmol/mg蛋白。

高效液相色谱分析。根据前面Qin等人所述方法分析人参皂苷CK及其酯的衍生物（CK-B

和ck-o）。可有轻微的变动。7高效液相色谱系统，高压液相色谱（安捷伦1100系列，小瀑

布，DE）与二极管阵列检测器（DAD）。检测波长为203nm。HypersilODS柱（150×3.9

毫米，水域，米尔福德，MA）进行样本分析。流动相为乙腈/水（85:15，V／V），流速为1

毫升/分钟。HPLC测定CK及其衍生物的标准浓度（0.05−50μM），测量峰面积以生成用于

样本定量的校准曲线。CK，CK-B和CK-O鉴别和定量的相应标准在甲醇溶液中制备。

HPLC法已被验证通过准确度，精密度，重复性实验。在浓度范围内（0.10−100μM），该方

法具较好的准确度（真实值的90-110%），精密度（日内和日间的变异系数小于15%）。样品

回收率为85-115%。定量限（LOQ），定义为在较好的准确度和精密度下的最小浓度，为CK，

CK-B，和ck-o分别是0.02，0.02，和0.01μM。

数据分析。测量每个时间间隔的待测化合物的累计量并绘制成时间曲线。流量被定义为每

平方厘米的单分子膜（nmol／cm2）通过的化合物的数量。根据下面的公式计算表观渗透系

数（Papp，厘米/秒）：

dQ/dt是渗透率（nmol／s）；A是inrt的表面面积（cm2）；C0为初始浓度。计算（B-A）

和（A-B）的渗透系数比来测定流出率（Re），如下方程：

学生进行t检验，统计学P-值小于0.05。所有的统计分析的进行采用Windows的SPSS13

软件。

结果：

CK，CK-B，CK-O的细胞毒性。转运实验前，采用MTT法试验评价CK，CK-B或

CK-O对于Caco-2细胞的细胞毒性直接测量细胞的活力。一般来说，细胞活性值小于对照

组的50%认为是线粒体活动的减少，而超过90%的高的细胞存活率，表明该浓度的化合物

对于细胞是无毒的。如图2所示，经过两小时曝光后，浓度范围在10-50μM或低于此范围

的CK，CK-B和CK-O，对于Caco-2细胞是无毒的。然而，观察到在大于50μM浓度时

具有显著的抑制作用。为了确保渗透实验中的细胞活性，浓度小于50μM的每种化合物用

做渗透性研究。

CK，CK-B，CK-O的Caco-2细胞吸收。图3表示了2小时内，Caco-2细胞对这三

种化合物（20μM）的从AP室进入到细胞膜内的细胞摄取结果。CK-B和CK-O吸收进入

Caco-2细胞发生很快，经过30分钟的孵育后，分别达到0.96的最高水平和0.74nmol/mg

蛋白。CK的细胞摄取比CK带CK-O低得多，30分钟的曝光到在AP端20μMCK的浓度

范围，具有的最大摄取为0.18nmol/mg蛋白。被Caco-2细胞吸收的CK，CK-B，和CK-O

分别占初始添加量的0.7%，3.6%，和2.8%。

CK，CK-B，CK-O的Caco-2细胞单层的转运。在20μM浓度，CK，CK-B和

CK-O通过Caco-2细胞单分子膜的双向渗透的时间过程如图4所示。CK的双边通量随时间

线性增加（图4a）。在2小时内，在AP到BL端方向上，CK的表观渗透系数（20μM）被

确定为8.75×10−7厘米/秒，这被认为具弱的渗透和吸收率。30BL到AP方向，渗透率高于

AP到BL方向2.6倍。最初的2小时，CK-B和CK-O在两个方向的流出量具类似的大小并

呈线性增加（图4b，C）。在ap-bl和bl-ap方向CK-B（20μM）的Papp值被确定分别为

2.86×10−6和3.57×10−6厘米/秒，外排率（RE）按1.2计算。ck-o（20μm）的Papp（A-B）

和Papp（B-A）分别为2.88×10−6和3.61×10−6厘米/s。

随后，浓度对CK，CK-B和ck-o（10−50μM）的运输通量的影响由AP-BL，BL–AP两个方

向决定。如图5A所示，长达2小时时间AP-BL方向上CK的通量基本上是线性的，在所测

得时间点没有任何明显饱和点，表现为浓度依赖的形式。这一结果表明，AP-BL方向CK的

转运主要是通过被动扩散。对应的Papp（A-B）值，在10−50μM浓度范围内被确定为

8.65×10−7厘米/秒，是与浓度无关的（P＞0.05）。然而，CK在BL-AP通量明显高于AP

到BL方向，并随浓度增加而增大，在浓度高于20μM.饱和。不同浓度的CK的确定的Papp

（B-A）值明显大于那些AP-BL所确定的，计算出的Re值分别为2.6，2，1.9，和1.6在20，

30，40，和50μM。浓度高于20μM时CK的Papp（B-A）的显著降低暗示了BL-AP方向

CK通量的饱和值。这一结果表明，CK的渗透机制可能是带有BL-AP主动外排的被动扩散。

在两个方向上的CK-B的流出量相似，并正比于10−50μM范围内CK-B的浓度（图5B）。

CK-B的Papp值，确定为AP-BL2.97×10−6厘米/秒及BL-AP3.58×10−6厘米/秒，不依赖于

浓度但是在两方向上和1.1−1.3的Re值有相似幅度。一般来说，Re值超过1.5的化合物的

运输流量被认为是主动外排。从ck-o的转运研究得到的结果CK-B（图5C）的类似。ck-o的

Papp值AP-BL2.84×10−6厘米/秒和BL-AP3.38×10−6厘米/秒，它是独立于浓度的，并在相

同方向上与CK-B的渗透率没有显著差异。因此，CK-B和ck-o通过转运Caco-2细胞单层

的渗透机制被认为是无主动外排参与的被动扩散。

不同化合物对CK，CK-B和ck-o转运的影响。研究了EGTA，维拉帕米和MK-571

对CK，CK-B及ck-o在Caco-2细胞的输送通量的影响。选择性钙离子螯合剂EGTA，因

可打开Caco-2单分子膜间的紧密连接而熟知，从而增强转运通过旁路。经EGTA预处理过

的Caco-2单层被用于CK，CK-B和ck-o的转运试验，来表征这三种化合物的跨细胞和细胞

旁转运的贡献。如图6A显示，用2.5μMEGTA在37°C预处理15分钟后所观察到的CK，

CK-B和ck-o的Papp值没有显着的效果，这表明旁路对他们的转运有很小的贡献。这一结

果表明这三种化合物的主要转运路线是跨细胞的。甘露醇，在EGTA处理实验中作为阳性

对照，是一个著名的细胞间转运药品。EGTA处理后年甘露醇增加的Papp值大于10倍表明

了在这项研究中的膜结合孔径的放大。

维拉帕米和MK-571分别是P-糖蛋白（P-gp）和MRP1/2的有名的抑制剂。P-gp和MRP1/

2在Caco-2细胞和其他肿瘤细胞的过度表达被作为最普遍的流出转运蛋白，和具有高容量

外排的细胞毒性药物。28为了探讨主动外排对为CK，CK-B和ck-o转运的介入，选择性

抑制剂维拉帕米和MK-571对这三种化合物转运的影响进行了检查。无论是AP-BL或

BL-AP，维拉帕米和MK-571对CK-B和ck-o的Papp值无显著影响（图6b，C）。同样，

MK-571在两个转运方向上对CK的Papp值也没有显著影响。然而，维拉帕米显著抑制CK

在BL-AP方向的流出（30%），并显著增加AP到BL的通量，这表明CK是P-gp的酶作用

底物。

讨论

包括人参皂苷CK在内的人参皂甙，据报道，表现出多种生物活性。然而，该人参皂甙口服

肠道吸收较差，这是一个限制因素，限制了它的在医学中的应用。因此，在本研究中，CK

的酯衍生物的设计是为了提高其口服生物利用度。CK和它的酯衍生物（CK-B和ck-o）的

传输机制的研究利用Caco-2细胞单层模型。

某些化合物Caco-2细胞单层的渗透性和在体内的口服吸收的密切的关系已获得。29众所周

知，Papp值小于1×10−6厘米/秒的化合物被认为具有较低的吸收（＜30%），但是Papp值在

1×10−6和1×10−5厘米/秒之间的化合物被认为有一个适度的吸收（30%−70%），那些Papp

值超过1×10−5厘米/s的被认为具有高的吸收（＞70%）。30根据这些标准，像CK一样在

Caco-2细胞单层的Papp值小于1×10−6厘米/秒的化合物从人体内肠的吸收可能较差，而其

酯衍生物（CK-B和ck-o）可能有中度吸收。以前的报告表明CK在大鼠中口服生物利用度

低（约5%），我们的研究结果和它是一致的。31、32然而，正如我们的结果显示，CK较低

的口服生物利用度可以通过将其酯化成为CK-B和ck-o而提高。

另一方面，在目前的研究中，CK，CK-B和ck-o的渗透机制，已被确定为被动扩散，CK油

有外排泵（P-gp）参与，而CK-B和ck-o无外排泵涉及。我们的结果表明，20μM的CK

的流出率（Re）为2.6，还有在BL-AP方向10−50μM范围内饱和通量，这表明它可能是流

出泵的一个酶作用物。由于在维拉帕米存在时（与之密切相关的P-gp的一个选择性抑制剂）

CK的渗透率在BL-AP的流出被明显抑制以及AP-BL流出增加，我们得出的结论是，外排

泵P-糖蛋白可能参与了CK在Caco-2细胞单层BL-AP的运输。MRP1/2并未涉及，正如

MK-571的影响缺乏所显示。因此，Caco-2细胞单层CK主要的传输机制是伴随有BL-AP

方向上流出的主动外排的被动的跨细胞扩散。我们的结果与杨等人的报告是类似的，该报告

还发现，在Caco-2细胞单层CK的渗透机制是有外排泵（P-gp）参与的被动扩散。33然而，

CK的吸收机制被报告为没有外排泵涉及转运的被动扩散，由于在Caco-2细胞的双向运输之

间没有差异，这与我们的结果矛盾。34该差异可能是由于在他们的研究中使用高浓度（高

达50μM）的酶作用物，这可能有可饱外排过程。同时，我们的工作表明，CK-B和ck-o

的渗透率在两个方向上的转运没有显著不同（1.2）并且和浓度无关。这与转运底物如维拉

帕米和MK-571影响的缺乏表明，CK-B和CK-O渗透机理是与主动外排无关的被动扩散。

药物分子口服后可以使用跨细胞（被动或主动）或旁（被动）路穿过肠上皮细胞进入循环系

统。35通常，亲脂性分子可能有一个显著的转运通过跨细胞途径的被动扩散，而低分子量

的亲水性分子通过肠上皮细胞主要是被动扩散过程。36因为较小的表面积可供分子进入细

胞间隙和细胞间的紧密连接，通过旁路吸收的效率比跨细胞路径要低。因此，旁路的贡献是

作为评估化合物的跨膜吸收过程的研究的首选转运机制之一。Caco-2细胞单层的紧密连接

的完整性的操纵，是通过在含有钙离子螯合剂介质（EGTA）的转运介质中钙浓度的消耗进

行的，这可以作为一个明确吸收路线的方法37通过旁细胞途径稀释通过Caco-2细胞单层膜

的化合物对紧密连接的完整性的操作非常敏感。在这次研究中，主要通过旁细胞途径吸收的

一种化合物，甘露醇的渗透，增加显著，这表明Caco-2细胞单层紧密连接的打开。我们描

述了CK，CK-B和ck-o跨Caco-2细胞单层转运的特征。打开紧密连接后，这三种化合物的

渗透系数值无明显变化，这表明CK，CK-B和ck-o转运通过Caco-2细胞单层主要是通过跨

细胞途径。亲水性化合物CK的吸收途径经发现是跨细胞。这可能是由于其相对高的分子量，

它将限制药物分子通过细胞间隙。

总之，我们已经清楚地表明，在Caco-2细胞模型中，CK-B和ck-o表现出比CK更好的膜

渗透。本研究可以为药物分子结构的改良提供一个有用的策略进而提高亲水性化合物的口服

吸收。