毫升微升

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线粒体呼吸链复合物I活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）活性比色法定量检测试剂是一种旨在使用合成辅酶Q同

功类似物和特异性抑制剂，通过反应系统测定样品中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值

的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成

功实验证明的。其适合于各种纯化线粒体样品（动物、人体、酵母）以及细胞或组织裂解悬液样品的还原

型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）－辅酶Q还原酶的特异性活性检测。其用于衰老、能量代谢、蛋白组

学、病理生理学、神经病变等研究。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，

反应优化，检测敏感。

技术背景

线粒体呼吸链复合物I，通常称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸辅酶Q还原酶（reducednicotinamideadenine

dinucleotidecoenzymeQreducta；NADH-CoQreducta），又称为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶

（reducednicotinamideadeninedinucleotidedehydrogena；NADHdehydrogena），是线粒体电子传递链中

最大的结构成分：含有30至40多个多肽结构。其特征性的酶活性是鱼藤酮敏感的NADH－辅酶Q还原酶

（NADH:QReducta）。复合物I催化线粒体内电子由供体NADH传递到内膜上辅酶Q受体（泛醌；

ubiquinone）的能量转移反应，为整个呼吸链反应系统的第一步。基于辅酶Q底物，在鱼藤酮存在与否的情

况下，通过NADH－辅酶Q还原酶的催化，转化成还原型泛醌（CoQH2），同时还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷

酸（reducednicotinamideadeninedinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide

adeninedinucleotide；NAD），在分光光度仪下产生吸收峰值的变化（340nm波长），由此定量测定NADH

－辅酶Q还原酶的特异活性。其反应系统是：

产品内容

缓冲液（ReagentA）毫升

反应液（ReagentB）毫升

阴性液（ReagentC）毫升

底物液（ReagentD）微升

专性液（ReagentE）微升

产品说明书1份

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融；反应液（ReagentB）含有毒性物质，避免直接用手接触；反应液

（ReagentB）和底物液（ReagentD），避免光照，有效保证6月

用户自备

比色皿：用于比色分析的容器

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双波长分光光度仪：用于比色分析

培养箱：用于孵育反应物

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液置入冰槽里融化；缓冲液（ReagentA）室温预热；反

应液（ReagentB）和底物液（ReagentD）注意避光。然后进行下列操作。

一、测定准备

1．准备好待测样品（例如纯化线粒体样品等），置于冰槽里（注意：检测前溶解线粒体；参见注意事项4）

2．设定好双波长分光光度仪（温度为30℃）：波长分别为340nm和380nm，间隔30秒，读数7次（共3

分钟），并置零（注意：参见注意事项10）

二、背景对照测定

1．移取xx微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升反应液（ReagentB）

3．加入xx微升底物液（ReagentD）

4．放进30℃培养箱里静置3分钟

5．加入xx微升阴性液（ReagentC）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟

三、样品总活性测定

1．移取xx微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升反应液（ReagentB）

3．加入xx微升底物液（ReagentD）

4．放进30℃培养箱里静置3分钟

5．加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项4）

6．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

7．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟

四、样品非特异活性测定

1．移取xx微升缓冲液（ReagentA）到新的比色皿

2．加入xx微升反应液（ReagentB）

3．加入xx微升专性液（ReagentE）

4．加入xx微升底物液（ReagentD）

5．放进30℃培养箱里静置3分钟

6．加入100微升待测样品（注意：10微克总线粒体蛋白；样品须溶解；参见注意事项4）

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7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）

8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：

（340波长读数－380波长读数）0分钟－（340波长读数－380波长读数）1分钟或3分钟

五、计算样品活性

1）样品活性（总活性或非特异活性）

2）样品特异活性

注意事项

1．本产品为30次（15个样本）操作，包括背景对照测定

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．线粒体样品检测前，须溶解；建议冻存融解（－70℃至37℃）循环3次或使用线粒体溶解试剂盒－

HL10018

5．加入样品启动反应后3秒内即刻比色测定

6．通常反应1分钟后比色测定值趋于稳定；测定值由高到低变化；测定可以持续3分钟

7．测定值由高到低变化，即3分钟测定读数低于0分钟测定读数，表明有酶活性

8．比色测定后，比色皿须清洗彻底

9．通常比色测定的OD340起始读数0.5为理想状态

10．如果用户没有双波长同步测定分光光度仪，可以使用单波长340nm替代，注意活性计算时，毫摩尔吸

光系数变成6.2

11．建议待测样本线粒体蛋白浓度为10微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样

本量；注意计算公式的调整（本公司提供线粒体溶解试剂盒HL10018为后续的线粒体蛋白浓度测定

的预处理试剂盒和Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HL30030.1）

12．如果使用细胞或组织裂解悬液，则蛋白浓度为50微克/100微升

13．样品特异活性是指鱼藤酮敏感的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸－辅酶Q还原酶，去除其它干扰因素（例

如复合物II/III/IV等）

14．如果用户需要研究线粒体呼吸链复合物I总活性包括鱼藤酮敏感和抗性之和，请咨询技术顾问，另购补

充反应液（ReagentB+）

15．线粒体呼吸链复合物I（NADH－辅酶Q还原酶）单位活性定义为：在30℃，pH7.5条件下，每分钟

内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位

16．本公司提供系列线粒体及其酶类技术产品

质量标准

1．本产品经鉴定性能稳定

2．本产品经鉴定检测准确