突触小体

肺腺癌患者突触小体相关蛋白家族的表达研究

黄兴;陆世民;王欣;陈辰;王洁;许林;任斌辉

【摘要】[Abstract]ObjectiveNumerousstudieshadshownthatsynaptic-

associatedproteins(SNAPs)wereclolyrelatedtotheoccurrenceand

ofthisstudywastoinvestigatethe

expressionofsynaptosomal-associatedprotein47(SNAP47)andits

correlationwiththeclinicopathologicalfeaturesinnon-smallcelllung

cancer(NSCLC).MethodsTheexpres-sionsofSNAPfamily(SNAP23,

SNAP25,SNAP29andSNAP47)wereextractedandanalyzedthroughthe

geneexpressionmicroarrayandthecancergenomeatlas(TCGA)data-

47mRNAexpressionin52casoflungadenocarcinomaand

theircorrespond-ingnormaltissuesweredetectedbyquantitativereal-

timePCR(qRT-PCR).ResultsAmong52casoflungadenocarcinoma,

SNAP47mRNAexpressionlevelsof41cas(78.9%)weresignificantly

higherthantheadjacentlungtissue(P<0.05).ThemRNAlevelofSNAP47

wasassociatedwithlymphnodeinvasionandadvancedclinicalpatho-

AlevelsofSNAP47ofpatientsinII/IIIstagewere

significantlyhigherthanthoofIstagepatients(6.558±4.730vs2.718

±2.370,P<0.05).ThemRNAlevelsofN1+N2werehigherthanthoofN0

(6.609±4.942vs3.360±2.987,P<0.05).ConclusionThehighspecificityof

SNAP47expressioninlungcancertissuesmightbeassociatedwiththe

invasionandlymph nodemetastasisofNSCLC,whichisthe

potentialtherapeutictargetoflungcancer.%目的：大量研究表明，突触小体

相关蛋白（synaptosomal-associatedprotein，SNAP）与多种肿瘤的发生发展

密切相关。文中旨在筛选并验证在肺腺癌中特异性表达的突触小体相关蛋白47

（synaptosomal-associatedprotein47，SNAP47）并分析其与临床指标间的

关系。方法应用表达谱基因芯片和肿瘤基因组图谱（thecancergenomeatlas，

TCGA）公共数据库筛选出特异性高表达于肺癌中的SNAP47，并选取江苏省肿瘤

医院有完整临床资料的52例肺腺癌患者，对其癌组织及对应的癌旁肺组织应用实

时定量逆转录聚合酶链反应检测SNAP47mRNA的表达情况，并分析其与临床指

标间的关系。结果52例肺腺癌组织中，41例（78．9％）SNAP47mRNA表达

水平明显高于对应的癌旁肺组织，差异有统计学意义（P＜0．05），且Ⅱ、Ⅲ期

患者SNAP47mRNA的表达水平（6．558±4．730）显著高于I期患者

（2．718±2．370），N1＋N2组患者SNAP47mRNA的表达水平

（6．609±4．942）也明显高于N0组患者（3．360±2．987），差异均有统计

学意义（P＜0．05）。结论SNAP47mRNA特异性高表达可能参与了肺腺癌的

浸润及淋巴结转移，是潜在的肺癌诊疗靶点。

【期刊名称】《医学研究生学报》

【年(卷),期】2015(000)006

【总页数】4页(P600-603)

【关键词】SNAP47;SNARE蛋白;肺腺癌;侵袭转移;实时PCR

【作者】黄兴;陆世民;王欣;陈辰;王洁;许林;任斌辉

【作者单位】210009南京，南京医科大学附属江苏省肿瘤医院胸外科;210009南

京，南京医科大学附属江苏省肿瘤医院胸外科;210009南京，南京医科大学附属

江苏省肿瘤医院胸外科;210011南京，南京医科大学第二临床医学院;210009南

京，江苏省恶性肿瘤分子生物学及转化医学重点实验室;210009南京，南京医科

大学附属江苏省肿瘤医院胸外科;210009南京，南京医科大学附属江苏省肿瘤医

院胸外科

【正文语种】中文

【中图分类】R734.2

0引言

肺癌发病率及病死率位居恶性肿瘤之首［1］。肺癌的侵袭转移是其恶性的标志和

特征，也是肺癌患者治疗失败和死亡的主要原因，约90%患者最终死于肺癌转移

［2］。当前针对肺腺癌驱动基因表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactor

receptor，EGFR)的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinainhibitor，TKI)治疗显示

了较好的临床疗效［3-5］，但肺癌总体5年生存率依然在20%～30%［6］。因

此筛选肺癌侵袭转移特异的新型分子靶标并探索其功能，是当前肺腺癌研究领域关

注的热点问题。包括肿瘤细胞在内，真核细胞内的膜性细胞器之间的物质运输(如

蛋白质、脂类)，主要通过囊泡完成;细胞通过囊泡运输系统完成生命活动，包括新

陈代谢、命运决定、增殖分化、运动迁移及损伤修复等［7］。有研究报道，N-乙

基马来酰胺-敏感因子受体(solubleNSFattachmentproteinreceptors，

SNARE)蛋白作为囊泡运输系统的核心，在基质金属蛋白酶的转运过程中起到了非

常重要的作用，从而促进了肿瘤的侵袭与转移［8-9］。而可溶性N-乙基马来酰

胺-敏感因子附着蛋白(synaptosomeassociatedprotein，SNAP)作为SNARE

蛋白的一种，主要参与了这一过程。SNAP蛋白家族作为SNARE复合物的一大类，

目前已知主要有SNAP23、SNAP25、SNAP29及SNAP474种蛋白，其中

SNAP23及SNAP47是全身表达的［10-11］。但目前尚无囊泡运输系统SNARE

复合物关于非小细胞肺癌的研究。因此我们认为针对非小细胞肺癌，挖掘肺癌相关

的SNAP，将有助于揭示肺癌侵袭转移的新机制，为临床诊疗提供新思路。

我们前期进行了大通量的基因芯片筛选，发现SNAP23是正常肺组织中主要表达

的SNAP蛋白，而SNAP47基因在肺癌组织中相对于癌旁组织的表达明显升高。

通过TCGA在线数据库(/)下载相应肺腺癌组织及

癌旁组织SNAP47RNAq数据，数据表明非小细胞肺癌标本中SNAP47

mRNA表达明显高于对应癌旁组织(P＜0.01)。因此，本研究应用TCGA数据库

进一步筛选验证SNAP在肺癌中的表达，并检测临床肺癌患者癌组织和癌旁组织

中相应SNAP47mRNA的表达，探讨其与临床病理特征的关系，为进一步研究

SNAP家族基因与肺癌的发生、发展关系奠定基础。

1资料与方法

1.1研究对象收集江苏省肿瘤医院2014年5月至2014年9月共52例肺腺癌患

者资料，其中男29例，女23例;年龄≥60岁者29人。取患者距肿瘤边缘5cm

处的正常组织做对照，所有癌组织标本均经病理检查明确诊断。新鲜标本取出后立

即置于液氮罐内冻存，然后转入-80℃保存。病理分期采用肺癌研究国际联盟

(IASLC)2009年公布的TNM分期，患者术前均未接受过放疗或化疗。患者的性别、

年龄、有无胸膜侵犯、分化程度、淋巴结是否转移、临床分型分期等临床资料完整。

1.2主要试剂和仪器总RNA抽提试剂TrizolReagent为美国Invitrogen公司产

品;Real-time逆转录试剂盒(R0036A)为Takara公司产品;SYBR®SelectMaster

Mix试剂盒和实时定量PCR检测仪购自美国AppliedBiosystems公司。

1.3引物根据Genebank公布的人SNAP23、SNAP25、SNAP29及SNAP47

基因序列，应用引物设计软件primer5.0设计引物，并经GenebankBlast检索

确定引物的特异性。内源性对照基因选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-

3-phosphatedehydrogea，GAPDH)。引物序列:SNAP47上游引

物:GCTGTCGCTCAGGTTCAT，下游引物:CTCCCTCCAGAAATGCTC;SNAP23上

游引物:CTGGGTTTAGCCATTGAGTCTCAGG，下游引

物:GGTGTCAGCCTTGTCTGTGATTCG;SNAP25上游引

物:ATGGATGAAAACCTAGAGCAGG，下游引物:ACACTTAAC

CACTTCCCAGC;SNAP29上游引物:ATGTCTGGCTATCCTAAA，下游引

物:CTGGCTTGGTACTTGTT;GAPDH上游引物:GAAGGTGAAGGTCGGAGT，下

游引物:GAAGATGGTGATGGGATTTC。所有引物均由上海Invitrogen公司合成。

1.4方法

1.4.1总RNA提取及浓度测定使用TRIzolReagent一步法提取肺腺癌细胞株及

肺癌组织标本总RNA，操作步骤严格按照说明书。随后经紫外分光光度计确定所

得到的RNAA260/A280比值在1.8～2.0之间，说明RNA无蛋白污染，符合后

续RT-qPCR实验要求。最后，通过A260的值计算RNA的浓度。总RNA提取

后加入100μL焦碳酸二乙酯(DEPC)水稀释，储存于-80℃备用。

1.4.2cDNA合成反应体系20μL。取1.5μgRNA，加入4μL

5×PrimeScriptTMRTMasterMix，然后加无RNA酶水至20μL。反应条

件:37℃15min，85℃5s，4℃15min行逆转录。合成好的cDNA置于-80℃

保存备用。

1.4.3实时定量逆转录-聚合酶链(realtimequantitativerevertranscription-

polymerachainreaction)反应反应体系10μL。2×SYBR®GreenReal-time

PCRMasterMix5μL，上游引物(5μmoL/L)0.4μL，下游引物(5μmoL/L)0.4

μL，cDNA2μL，加DEPC水至10μL。将反应管置于7300Real-timePCR反

应仪(AppliedBiosystem中)，反应条件为95℃预变性10min后，按下述条件

扩增40个循环:95℃10s，60℃1min。每个实验重复3次。采用2-ΔΔCT法计

算基因的相对表达量［12］，公式如下:

ΔΔCt=ΔCt-Avg.ΔCt=(CtSNAP47-CtGAPDH)-Avg.

(CtSNAP47-CtGAPDH)

1.5统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析。定量资料用均数±标准差()表

示。肿瘤及瘤旁组织SNAP47表达均数比较采用配对t检验，两独立样本均数的

比较视方差齐性检验(以0.1作为检验水准进行Levene检验)结果，当方差齐同时，

用两独立样本t检验，当方差不齐时，用Satterthwaite校正t检验。以P≤0.05

为差异有统计学意义。

2结果

2.1SNAP47mRNA在肺腺癌及癌旁组织中的表达SNAP47mRNA在正常肺组

织和肺癌组织中都有表达，且52例中有41例(78.9%)的SNAP47mRNA表达水

平高于正常组织，其中33例(63.5%)比正常组织高2倍以上，20例(38.5%)比正

常组织高4倍以上，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2肺癌组织中SNAP47mRNA表达与临床病理特征的相关性分析在低分化与中

高分化的患者中，SNAP47mRNA表达的差异不具有统计学意义(P=0.476)。

SNAP47mRNA的表达量与患者性别和年龄及胸膜侵犯情况之间的差异无统计学

意义(P＞0.05)。但在不同临床分期中不同，肺癌Ⅱ、Ⅲ期患者SNAP47mRNA

的表达水平显著高于I期患者，N1+N2组患者SNAP47mRNA的表达水平也明

显高于N0组患者(P＜0.05)。见表1。

表1SNAP47mRNA表达与临床资料相关性分析Table1Correlationbetween

SNAP47mRNAlevelandclinicopathologiccharacteristics特征n表达比例P

值性别男294.588±4.4150.611女235.203±4.201年龄(岁)≥6029

4.886±3.3780.969＜60234.839±4.978胸膜侵犯有285.368±4.1120.365无

244.267±4.505淋巴结转移N0283.360±2.9870.005N1+N224

6.609±4.942分化程度低134.084±4.5070.476中高395.118±4.245TNM分

期Ⅰ232.718±2.3700.001Ⅱ、Ⅲ296.558±4.730

3讨论

寻找并研究肺癌侵袭转移相关的基因，对改善肺癌患者预后意义重大［13-14］。

基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteina，MMP)降解细胞外基质是肿瘤的侵

袭和转移的关键环节。SNARE复合物(VAMP3，Stx13及SNAP23)参与基质金属

蛋白酶的转运分泌进而降解细胞外基质实现纤维肉瘤细胞(HT-1080)的侵袭转移

［9］。而Williams等［15］在侵袭性乳腺癌细胞株中证实SNARE复合物

(VAMP7，Stx4及SNAP23)介导侵袭伪足形成和膜相关MT1-MMP的转运从而

影响肿瘤细胞侵袭。

SNAP家族作为SNARE家族的一员，在MMP转运过程中起到了关键的作用，从

而参与了肿瘤的侵袭、转移。本组通过前期的芯片发现SNAP47基因在肺腺癌中

的表达明显增高。因此，本研究探讨SNAP家族在肺癌组织中的表达及其临床意

义。研究结果显示:TCGA数据库中，SNAP47在包括肺腺癌在内的非小细胞肺癌

中的表达明显高于对应瘤旁组织，SNAP23为低表达，SNAP25及SNAP29的表

达无明显差异。随后，针对52对新鲜标本组织，应用qRT-PCR方法检测了

SNAP47mRNA的表达，结果发现:癌组织标本中SNAP47mRNA的表达明显高

于癌旁组织，且SNAP47mRNA的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移等情况有

密切的联系。SNAP47mRNA的表达在不同TNM分期有显著的差异，随着肺腺

癌临床分期的增高，SNAP47的表达也相应增高，在Ⅱ、Ⅲ期患者的表达水平明

显高于I期，根据此结果可以推测SNAP47参与了肺腺癌的发生及发展过程。

N1+N2组患者SNAP47的表达水平明显高于N0组，表明SNAP47的表达水平

与淋巴结转移情况有密切的联系，这从另一方面提示SNAP47参与了肺腺癌的发

生发展。由于肿瘤较小，无法进行T分期的分层分析，因此SNAP47是否与肺癌

的T分期相关仍需进一步的研究。

综上所述，SNAP47的高表达可能与肺癌的发生发展有关，参与了肺腺癌的浸润

转移及淋巴转移，有望作为肺癌的预后和转移指标或治疗靶点。基于前期SNAP

家族蛋白在MMP转运中的研究，我们推测SNAP47也可能通过增加MMP的转

运实现肺癌的侵袭转移。进一步的体内体外实验有助于明确SNAP47对于肺癌侵

袭转移的作用并揭示其可能的机制。

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