免疫活性细胞

过继性T细胞治疗是过继性细胞免疫治疗研究的重点，但对MHCI类分子阴性

的肿瘤细胞无效，而NK细胞(Naturalkillercell,NK细胞)由于表达MHCI类分子

的抑制性受体-杀伤细胞抑制性受体(Killerinhibitoryreceptor,KIR)，可以杀灭

MHCI类分子阴性的肿瘤，随着对NK细胞研究的深入，目前NK细胞用于肿瘤

免疫治疗成为研究热点。19世纪80年代兴起的细胞过继免疫治疗带给了肿瘤患

者一个新的希望。自然杀伤(naturalkiller,NK)细胞作为机体抗肿瘤的第一道防线，

再加上其对肿瘤细胞的杀伤作用是由其表面抑制性受体和活化性受体的共同信

号决定，所以NK细胞成为近年细胞过继免疫治疗的研究热点。

自然杀伤细胞表面标志与分类

1．依据表面标志分为CD56bright和CD56dim两个亚群NK细胞表达众多表

面分子，但只具有相对特异性。通常将CD56+CDl6+CD3-TCR―BCR―的淋巴

样细胞定为NK细胞，并以CD56的表达密度不同，将NK分为CD56bright和

CD56dim两群。CD56brightNK细胞高表达CD56、CD94／NKG2A和L选择素

(CD62L)；低表达CDl6和KIR；表达高亲和力的IL2受体(1L-2RapY)。而CD56dim

NK细胞高表达CDl6、PEN5、KIR和LFA―1；低表达CD56，CD94／NKG2A；

仅表达不带。链的中亲和力的IL-2受体(IL-2Rβγ)。

NK细胞亚群CD56bright和aD56dim的表型特点

2．依据细胞因子分泌格局分为NKl和NK2两个亚群NK细胞也存在着类

似Thl和Th2样的亚群。分离外周CDl6+，或CD56+细胞，用ILl2和抗IL―4

抗体可以诱导出分泌IFN―Y的Thl型NK亚群，用IL4和抗体诱导出分泌IL5、

ILl3的Th2型NK细胞亚群，分别命名为NKl和NK2。也有人认为NK细胞发

育经历K2一NK0一NKl的过程。在这一过程中IL4促进NK2增殖；ILl2促

使NK2向NKl转变，并促进NKl的或熟。

3．依据黏附功能分为黏附NK和非黏附NK两个亚群根据NK细胞在IL2

的诱导下表现出的黏附能力，分为黏附NK(A―NK)和非黏附NK(NA―NK)两个

亚群。A―NK细胞的表型比较均一，主要为CD3―CD56dimCDl6十IL2R+，不

含CD56bright细胞。NA―NK细胞是具有不同表型的异质性群体，各种表型如

CD56bright、CD56dim、CD56―、CDl6十、CDl6―均可存在。

方法：1.采取10例健康志愿者和山西省肿瘤医院血液科10例AML患者外周血

15ml,运用常规单个核细胞提取法提取单个核细胞，分别放于含有SCGM培养基

的培养孔中培养，前5d加入0.5ulCD3McAb，在培养的第5d，倒掉含有CD3McAb

的培养液，加入含有rhIL-2的SCGM培养基。隔日补充一次培养液，直至第25d。

2.运用细胞计数仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及第25d的细胞数量及

细胞存活率。

3.运用流式细胞仪检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d细胞中的NK细

胞百分率和T细胞百分率。

4.采用比色法检测培养第0d、5d、10d、15d、20d及25d分选出的NK细胞对

K562细胞和RPMI8226细胞的杀伤活性。

健康志愿者即健康人群NK细胞的最佳培养时间间期是20d。

1．细胞增殖活性的测定采用改进的四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法

于培养的第1，4，7，10和第14天分别取细胞，充分洗涤，以1×106/ml浓度

加入96孔平底板中，每孔0.2ml，设3个复孔，培养箱中培养48h后，每孔加

MTT（5mg/ml）20ul，继续培养4h，然后翻板，每孔滴加100ul二甲基亚砜（DMSO）

轻轻振荡10min后在酶标仪上570nm处测定吸光度（OD值），取3孔均值，OD

值高则增殖快。

2.细胞杀伤活性的测定采用MTT法进行免疫活性细胞的细胞毒性测定

靶细胞为Anip973和K562肿瘤细胞，效应细胞为完全培养基和AIMV分别培养

的A-NK细胞和NA-NK细胞，效靶比例为100:1。设立效应细胞和靶细胞共同

孵育孔（E+T），效应细胞对照孔（E）和靶细胞对照孔（T），每组设3个复孔，

操作方法同1.4。测定的OD值，取3孔均值，公式如下［2］:细胞杀伤活性

（%）=［1+（ODE+T-ODE）/ODT］×100.

3.细胞表型分析

细胞诱导3～5h后，分别收集完全培养基和AIMV培养的A-NK细胞和NA-NK

细胞，按5×105个细胞/管，用美国Becton-Dickinson公司的流式细胞仪检测

并分析CD11c的表达。

4.透射电镜标本制备

在培养瓶中将A-NK细胞和K562肿瘤细胞共同培养，过夜，第二天取出离心

（4000rpm×5min），

用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常规处理电镜标本。

目的：通过改进培养基及细胞因子体系从而制订更优的NK细胞体外培养扩增方

案，为临床NK免疫细胞治疗提供实验依据。

方法：4例血细胞分离机单采的新鲜白细胞及3例复苏的G-CSF动员后的外周血

造血干细胞(PBSCs),通过破红、去血小板、弃贴壁细胞等处理,调节悬浮细胞浓度

至5×106/ml，添加细胞因子(包括1000U/mlrhIL2、10ng/mlrhIL12、10ng/mlrh

IL15、10ng/mlrhIL21)后培养于37℃5%CO2孵箱中6天。根据不同培养基及是

否添加rhIL-18将实验组分为AIM-V±rh-IL18组及SCGM±rh-IL18组,rhIL-18浓

度为20ng/ml。每隔2~3天半量换液，调节细胞浓度至2×106/ml,并补充相应细胞

因子。收集培养到第3天(D3)及第6天(D6)的细胞进行计数、NK纯度及功能表

型检测。

结果：SCGM+rhIL18相比AIM-V组能使NK细胞扩增能力明显增强,培养到D6

天NK细胞绝对值上调4~8倍,NK纯度提高10%~20%(P0.05)。培养到D6天

时,SCGM+rhIL18相比AIM-V组能使NK细胞的穿孔素、颗粒酶的表达分别上

调(19±4)%及(10±4)%(P0.05),迁移表型CD62L及成熟表型CD57的表达分别上调

(12±4)%及(7±2)%(P0.05)。而且SCGM+rhIL18能使NK细胞分泌更高水平

IFNγ(P0.05)。另外,NK细胞的功能表型及分泌IFNγ的能力随着培养时间的延长

明显递增(D6D3D0)(P0.05)。

结论：本实验证明SCGM培养基联合IL-12/15/18是体外培养制备NK细胞的更

好策略,能进一步提高NK细胞的纯度、绝对值、功能表型及分泌IFNγ的能力。

本实验为临床上同种异体NK细胞治疗移植后复发AML提供了理论依据：有望

进一步提高GVL效应并减少GVHD发生。

恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在男性中居第六位，女性中居第八位，儿童及

35岁以下成人中则居第一位。白血病的治疗目前包括放、化疗药物降低瘤负荷

获得缓解；移植和免疫治疗。CTL(CytotoxicTcell,CTL)细胞目前在血液临床

方面主要应用于外周血干细胞移植和其他过继免疫治疗中。根据移植物的来源不

同移植分为自体移植和同型异体移植。自体外周血干细胞移植(Auto-HSCT)无G

VHD，移植后生活质量较高，但因无GVLE(graft-versusgosteffect,，GVLE)，

易复发。自体外周血干细胞移植主要靠自身CTL细胞杀灭肿瘤细胞。如果在移

植后辅助性输注一定量的自身体外诱导的白血病抗原特异性的CTL细胞，复发

问题可能会在一定程度上得以解决。或自体移植的基础上输入一定量的供者来源

的白血病细胞特异性的CTL细胞，增加GVLE，在某种程度上可能会改变自体

移植的效果。异基因造血干细胞移植(Allogeneicsterncelltransplantion,Allo-S

CT)，由于存在GVLE，使得一些患者能够得以长期生存，然而伴随而来的移植

物抗宿主病(Graftversushostdia,GVHD)，严重感染，植入失败，造血重建

延迟等相关并发症成为移植成功的巨大障碍。CTL细胞是GVHD及GVLE的效

应细胞，也是预防移植后感染、促进植入和造血重建的重要免疫细胞。供者淋巴

细胞输注(Donorlymphocytetransfusions,DLT)能诱导出GVLE消除白血病复发，

CTL细胞是它的主要效应细胞。DLI在受者体内也会产生多种移植相关并发症，

如何得到最佳疗效，使DLI得到更好的应用，是现在临床面临的一大课题。

ALL细胞表面缺乏淋巴细胞功能性抗原(LFA-1)，ALL对NK的治疗效果差，C

TL细胞似乎成了除了药物唯一能针对ALL肿瘤的效应细胞了。CTL细胞在免疫

治疗思想及技术路线上已经展示出了它的重要性。临床上发现，植入是否成功以

及GVHD的严重程度与移植后供、受体T细胞比例显著相关。异基因干细胞移

植即便是完全供者型，也并没有彻底去除受者的效应细胞及记忆细胞，找出针对

自身肿瘤细胞的受者的CTL克隆，发挥RVLE(Recepient-versusleukemieffect,

RVTE)，在排斥及RVLE之间找到最佳平衡点，不仅能发挥自身识别肿瘤的免

疫清除功能，而且协同供者成分发挥杀瘤效应，同时有助于了解代替免疫与过继

免疫的理念，分析临床上见到的一些患者移植失败后并无疾病复发获得长时间生

存，而一些患者在完全供者嵌合(FDC)状态下出现原疾病复发的原因。Wilmstu

morantigen-1(WT1)过度表达在70%-90%的ALL病人中，而这样的病人有着高

的复发率。体外及小鼠研究中的证实，WT1是一个有意义且广泛表达的白血病

抗原靶标。髓性白血病和健康供者中有WTl特异性的T细胞，说明WTl的表达

很容易诱导出T细胞反应。WT1特异性的CD8+的T细胞和白血病肿瘤负荷减

轻密切相关。高度纯化CD8+T细胞混合骨髓移植会产生高GVL效应低的致死

性GVHD已得到证实。如果能够培养分离出具备高度选择性杀伤白血病细胞的

CTL克隆，对正常细胞无明显作用，无GVHD，无排斥，宿主完全耐受，扩增

率高并能在体内增殖，具有强大的细胞毒性及白血病细胞清除能力，那么分离G

VHD与GVL即将成为可能，改善自体移植效果成为可能，增进过继免疫治疗成

为可能。那么如何在体外得到高度纯化的抗原特异性CTL细胞？这就是本实验

的主要研究目标：拟在体外分离培养CD8+WT1特异性的CTL细胞克隆，并从

多方位鉴定其功能特性及其来源，为进一步的研究及应用打下坚实的基础。

方法：1.体外DC培养树突状细胞(dendriticcell,DC)主要的功能就是特异性抗

原提呈。成熟DC加工处理抗原肽-MHC-1复合物，并提呈给T细胞。DC传统

培养方法大致需要4-10天，前几天为诱导分化期，最后一天为诱导成熟期。DC

成熟所需时间太长，与体外CTL培养不能同步。我们改进了DC培养为2天诱

导成熟法。与传统培养法及7天培养法方法比较：(1)利用四色流式细胞技术进

行表型分析。(2)利用倒置显微镜及瑞-吉染色行形态观察。(3)通过HLA-A*0201

同型的Tc细胞对WT1/HLA-A*0201阳性肿瘤细胞NB4的杀伤率来评价DC的

提呈功能。2.健康供者CTL细胞单个克隆培养(1)免疫磁珠分选CD56-CD8+细

胞：HLA-A*0201健康供者外周血单个核细胞(PBMNC)行免疫磁珠去CD56+的

细胞(NK)细胞，再行CD8阳选，PHA/WTI肽间段性刺激下行体外扩增。(2)流式

细胞分选：以CD19-细胞群中设门，WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性

的细胞为目的CTL细胞，收集。(3)饲养细胞的制备：三人份非HLA-A*0201阳

性的健康供者PBMNC进行γ-射线50Gy照射，制备成饲养细胞。(4)CTL细胞克

隆制备：所分选的目的细胞行有限稀释法制备单个克隆，按比例与抗原负载的D

C及饲养细胞混合后体外扩增培养。(5)CTL克隆细胞表型鉴定：流式检测CD4

5RA/CD45RO、CCR7、CD3、CD8、CD28、CD27、CD107a分子的表达率。(6)

CTL克隆胞内分子检测：流式检测胞浆毒性颗粒GranzymeB、Perforin的阳性率。

(7)分泌功能检测：CBA法检测IL-2、IL-4、1L-6、IL-10、TNF-α、IFN-y、IL-1

7在CTL细胞培养上清的浓度。(8)细胞毒性的检测：克隆细胞对标准瘤株及白

血病原始瘤苗杀伤率来鉴定其细胞毒功能。3.白血病NASCT患者外周血来源

的CTL单个克隆培养(1)体外刺激扩增：加用刺激因子与WT1肽进行体外特异

性Tc细胞诱导扩增。(2)扩增后的Tc细胞流式分选：CD3+CD19-细胞群设门，

WT1/HLA-A*0201/Pentamer及CD8双阳性的细胞分选后收集(CTL细胞)。(3)三

人份非HLA-A*0201阳性的健康供者外周血单个核细胞进行Y-射线50Gy照射，

制备成饲养细胞。(4)有限稀释法制备克隆细胞，按比例混合抗原负载的DC及饲

养细胞体外扩增培养。(5)流式检测克隆表型分子CD45RA/CD45RO、CCR7、C

D3、CD8、CD28、CD27、CD107a的表达率。(6)CTL克隆细胞胞浆毒性颗粒G

ranzymeB、Perforin的阳性率检测。(7)CBA法检测克隆细胞分泌的IL-2、IL-4、

IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17的浓度。(8)克隆细胞对标准瘤株及白血病原

始瘤苗杀伤率的检测来鉴定其功能(CFSE/PI双标法)。四、白血病NASCT患者

与健康供者体外培养CTL克隆的比较研究利用上述方法体外平行培养两类不

同来源的CTL克隆，进行表型、毒性颗粒、分泌及杀伤功能鉴定。五、CTL克

隆细胞来源与功能的镜下研究(一)性别染色体荧光原位杂交(FISH)区别CTL克

隆的来源选用5例供受者性别差异的白血病移植后患者体外CTL克隆细胞进行

性别探针杂交，荧光显微镜下观察杂交信号，根据x,Y染色体的不同信号来鉴定

克隆来源。(二)激光共聚焦扫描镜下观察CTL克隆的形态与功能选取受者为H

LA-A*0201阳性、供者非HLA-A*0201阳性的白血病HLA半相合NASCT后患

者体外培养WTl特异性CTL克隆细胞，WT1/HLA-A*0201/Pentamer-PE标记C

TL细胞，PKH26标记DC，CFSE标记靶细胞NB4(WT1及HLA-A*0201双阳性

的人急性早幼粒细胞白血病瘤株)，共同孵育2h，镜下观察形态与功能。(三)扫

描电镜观察克隆细胞细微结构与功能白血病移植后患者WT1阳性的CTL克隆

细胞体外培养4-6周后，收集细胞并依次与DC及NB4细胞以一定比例混合培

养2h后，收集处理细胞，镜下观察克隆细胞的功能。六、白血病NASCT患者

与健康供者CTL克隆蛋白表达差异分别选取三份健康人及白血病患者移植后

体外扩增培养6周后的CTL克隆细胞，收集细胞裂解、提取蛋白、测浓度、双

项电泳、染色、扫锚、图像分析。建立蛋白差异谱,确定差异蛋白，酶切，质谱

分析。健康人外周淋巴细胞及白血病移植后外周血未培养的淋巴细胞做为基础蛋

白差异谱对照，生物信息检索分析找出反应蛋白。结果一、体外树突状细胞培

养1、3种方法培养的未成熟及成熟DC在形态上无差别；2、3种培养法未成熟

DC表型存生明显差异：传统培养法CD1a,CD86(P0.01),CD83,HLA-DR(P0.05)的

表达均明显高于2天法；传统培养法CD1a(P0.01)的阳性表达率明显高于7天法；

7天培养法CD83,HLA-DR(P0.05)的表达明显高于2天法；7d法的CD83(P0.05)

明显高于传统法；成熟DC表型差异：2天培养法与7天培养法无差异；2天培

养法CDla,CDllc,CD80,HLA-DR的表达明显高于传统培养法(P0.05)；7天培养法

CD80,CD83的表达明显高于传统培养法(P0.05)；3、3种培养法成熟DC的抗原

活性：2天及7天培养法DC辅助Tc对靶细胞的杀伤率(75.8±7.1)%,(74.6±3.2)%

明显高于传统法(65.2±1.3)%(P0.01)。二、健康供者CTL克隆细胞培养与鉴定

1、表型：CD3+CD8+的细胞占(98.7±0.2)%,CD27占(62.3±10.0)%,CD28占(71.9±

7.9)%；CD107a占(49.0±11.0)%,CD45RA占(65.1±8.4)%,CD45RO占(34.3±±4.2)%,

CCR7占(18.1±5.2)%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(43.9±7.4)%,穿孔素：

(32.7±6.8)%。3、CTL克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+细胞群占(9.0±2.0)%；

CD45RA-CD45RO+CD27+CCR7+的细胞群占(13.0±2.4)%；CD45RA-CD45RO+C

D27+/-CCR7-细胞群占(26.1±±5.9)%；CD45RA+CD27+/-CD28+/-占(61.3±7.9)%。

4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体及CD8双阳性率在(76±3.9)%。5、分

泌功能(pg/ml)：IL-2浓度为(2129.5±±414.7)、IL-4(17.5±9.1)、IL-6(21.6±9.7)、IL

-10(24.8±8.6)、TNF-α(40.8±21.5)、IFN-γ(102.3±61.0)、IL-17(18.5±8.6)。6、对N

B4的杀伤率(89.7±7.6)%明显高于对U937和K562杀伤率(19.0±4.3)%,(19.7±5.

2)%,P0.05。对白血病原始瘤苗AML和ALL的杀伤率(54.0±16.6)%,(56.5±12.4)%,

无差别P0.05。三、白血病NASCT患者CTL克隆细胞的培养与鉴定1、表型：

CD3+CD8+的细胞占(98.6±0.5)%,CD27占(66.3±8.1)%,CD28占(70.1±7.8)%；CD1

07a占(51.4±7.7)%,CD45RA占(65.7±6.3)%,CD45RO占(33.9.1±4.5)%,CCR7(17.1±

2.7)%。2、胞内毒性颗粒表达率：颗粒酶B：(40.6±9)%,穿孔素(30.9±6.2)%。3、

克隆亚群比例：CD45RA+CD27+CCR7+占(12.6±3.2)%CD45RA-CD45RO+CD27+

CCR7+占(17±4.6)%；CD45RA-CD45RO+CD27+/-CCR7-占(19.5±3.6)%；CD45R

A+CD27+/-CD28+/-占(62.1±7.4)%。4、五聚体检测：WT1/HLA-A*0201五聚体

及CD8双阳性率在(70.2±8.5)%。5、分泌功能：IL-2(2365.0±246.1)%、IL-4(40.5

±8.3)%、IL-6(1705.3.6±416.2)%、IL-10(63.2±22.2)、TNF-α(121.3±35.3)%、IFN-γ

(219.5.3±65.1)%、IL-17(14.5±5.0)%。6、对NB4的杀伤率(84.5±5.1)%明显高于对

U937和K562杀伤率(21.5±5.5)%,(22.3±6.5)%,P0.05。对白血病原始瘤苗AML和

的杀伤率(66.4±7.6)%明显高于对ALL的杀伤率(58.6±5.6)%,P0.05。四、白血病

NASCT患者与健康供者CTL克隆比较两者表型无差异：毒性颗粒表达率无差

异；患者分泌的细胞因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ明显高于健康供者(P

0.01),IL-17无差别(P0.05)；细胞毒功能未发现明显差别。五、白血病NASCT

患者CTL克隆来源与功能研究1、FISH发现了白血病NASCT患者体外培养C

TL克隆中有受体的CTL细胞；2、LMST发现白血病NASCT后受者的CTL细

胞并直接观察到其细胞毒性。2、高分辨扫锚电镜下观察,发现培养的CTL克隆

细胞呈典型T细胞形态,与DC细胞间有丝状物交通联络,并杀伤溶解靶细胞的功

能。六、两类单克隆CTL细胞蛋白表达差异1、NASCT患者与健康供者外周

血未培养的淋巴细胞蛋白差异点有30个,鉴定出13个功能明确的蛋白。2、白血

病NASCT患者与健康供者CTL克隆细胞差异蛋白点44个,鉴定出25个功能蛋

白,明显上调的18个,下调的12个,4个为未命名蛋白。3、白血病及移植相关的共

同反应蛋白有4个,分别为Coactosin-likeprotein、Septin-1]、Purinenucleoside

phosphoryla,GATA3。结论(1)2天诱导成熟的DC形态功能都达到功能DC的

标准，这种培养方法是成功的。(2)健康人与白血病患者体外CTL单个克隆培养

方法是成功的、在体外能有效扩增(单个细胞扩增到1-5×107个细胞)，扩增成功

率为78%。经一系列鉴定,培养的克隆细胞表型、功能均为功能性CTL细胞。(3)

培养的CTL克隆细胞亚群包括一定比例的记忆细胞表型，说明克隆细胞是由一

个细胞分化增殖形成不同阶段的细胞亚群组成。(4)白血病NASCT患者来源的C

TL克隆分泌功能明显比健康供者的CTL克隆旺盛。(5)免疫磁珠分选结合五聚体

流式分选可以得到高纯度的CD8+的CTL细胞，可以做为单个克隆培养的备用细

胞。(6)HLA限制性肽特异性的五聚体与FISH相互补充，可以鉴定一部分NAS

CT患者CTL克隆的来源。(7)健康供者与白血病NASCT患者之间的PBMNC及

CTL克隆在蛋白表达上存生着明显差异。

CIK是“Cytokine-InducedKillerCells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细

胞”。CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ、IL-2等)的作用

下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T

淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织

相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常

组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细

胞。

DC是“DendriticCells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树

突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家

an于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞

(AntigenPrentingCells,APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Na?ve

Tcells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞、B细胞等)仅能刺激已活化的或

记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有

极其重要的作用。

DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效

应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，

共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增

殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有

效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细

胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿

瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。

1．DC培养用细胞因子：

GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)：

GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，

并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的?功能。GM-CSF是最早

被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。

GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC

II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF还可促

进DC的存活。

IL-4(白细胞介素-4)

IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从

而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬

细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降

低是单核细胞分化为DC的重要标志。

GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immatureDC)，此时

的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达

MHCI类、II类分子和B7家族分子(CD80,CD86等)，但不?表达CD14。

TNF-α(肿瘤坏死因子-α)

TNF-α可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHCII

类分子区室(classIIcompartment)消失，但能够上调细胞表面?MHCI类、II类分子和

B7家族分子(CD80、CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(matureDC)，

此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激

活T细胞。

2．CIK培养用细胞因子和抗体：

CD3激发型单抗：)

T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(Tcellantigen

receptor,TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识

别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过

非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T

细胞表面的?辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相

连的酪氨酸激酶(Lck、Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨

酸活化基序(immunoreceptortyrosine-badactivationmotif,ITAM)中的酪氨酸(Y)磷

酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化

的级联反应(磷脂肌醇途径MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入

细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(?如IL-2和IFN-γ等)，引起基

因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。

由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发

型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序

中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细

胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识

别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺

的刺激因素。

此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3

的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型

单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克

隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。

IL-2(白细胞介素-2)

IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor,TCGF)，是引起T细胞

增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过

与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分

裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞

培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。

IFN-γ(干扰素-γ)

IFN-γ具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2

促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN-γ，可降低IL-2

的用量。研究发现，IFN-γ加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-γ，

培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。

IL-1a(白细胞介素-1a)

IL-1a也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1a与IFN-γ和激发型

CD3单抗合用时，可以明显提高CIK的细胞毒作用。

1.

外周血单个核细胞的采集

1.1

用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞

80-100ml

；

1.2

淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞

(PBMC)

；

1.3

无血清培养液洗涤

2

次，获得纯度在

90%

以上的

PBMC

，细胞数量需达到

1-3x

108

。

2

．

(

可选步骤

)

肿瘤抗原的制备

]

用于负载

DC

的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽

(Tumor-SpecificAntigens,TSA)

或肿瘤相关抗原

(Tumor-AssociatedAntigens,TAA)

，也可以是肿瘤全细胞抗原。

用

TSA

或

TAA

负载的

DC

具有很好可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原

是肿瘤细胞的

TSA

或

TAA

，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击

DC

可诱导产

生针对不同抗原决定簇的细胞毒

T

淋巴细胞

(CTL)

克隆，从而实现对肿瘤细胞的有

效杀伤。

肿瘤细胞全抗原负载

DC

的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载

DC

、用凋亡肿

瘤细胞负载

DC

、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载

DC

，用肿瘤活细胞负载

DC

，和将

肿瘤细胞与

DC

融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载

DC

，因该方

法简单、快速、有效。

反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：

2.1

手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；

2.2

无菌生理盐水洗

3

次；

2.3

用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入

RPMI1640

培养基，充分研磨；

2.4200

目无菌网过滤后收集单细胞悬液；

2.5

用

RPMI1640

培养基重悬细胞至

1-2x107/ml

，装入

5ml

无菌冻存管中；

2.6

将冻存管浸入液氮中速冻，

10min

后取出，再迅速放入

37

℃水浴中解冻

10min

。

反复

3-5

次；

注：也可以

-80

℃

/37

℃反复冻融

3-5

次。

2.7

将肿瘤裂解物加入离心管中，

3000rpm

，离心

10min

；

2.8

收取上清，

0.22μm

滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；

2.9-80

℃保存备用。

3.0CIK

细胞的培养及鉴定

3.1

步骤

1

中获得的

PBMC

用无血清培养液调整细胞浓度至

2x106/ml

，置于培养

瓶内；

3.237

℃，

5%CO2

培养箱中孵育

2h

，以使单核细胞贴壁；

3.3

收集悬浮细胞，用无血清培养液调整细胞浓度至

1-2x106/ml

；

3.4

加入

1,000U/ml

的重组人

IFN-γ

培养；

3.524h

后加入

50ng/ml

的

CD3

单克隆抗体和

300U/ml

的重组人

IL-2

，刺激

CIK

细胞的生长和增殖；

注：此时也可同时加入

100U/ml

的重组人

IL-1a

。

3.6

每

3

天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人

IL-2300U/ml

；

3.7

在培养的第

7d

，收获

CIK

细胞

,

此时数量应达到

1x109

个以上；

3.8CIK

细胞质控：

3.8.1

台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在

80%

以上；

培养细胞活力的检测台盼蓝排斥实验

1.

制备单个细胞悬液，适当稀释；

2.

向细胞悬液中加入

0.4%

台盼蓝溶液，使台盼蓝终浓度为

0.04%

；

3.在三分钟内用血球计数板分别计数活细胞和死细胞，死细胞被染成淡蓝

色。

注意事项：在三分钟内完成死细胞计数，否则部分活细胞也会被染色，影响实验

的准确性。

3.8.2用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表达，观察

CD3+CD56+细胞的比例是否明显提高。

细胞的培养及鉴定

4.1步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF

500-1,000U/ml和重组人IL-4500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培

养，诱导单核细胞向DC细胞分化；

4.2每3d半量换液一次，并补足细胞因子；

4.3(可选步骤)?在培养的第5d,加入步骤2中获得的肿瘤抗原50mg/ml，对DC进

行抗原负载；

注：若不对DC进行抗原负载，该步省略。

4.4在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC细胞成熟；

4.5在培养的第7d或第8d，收获DC细胞，其数量应达到1×106个以上；

4.6DC的质检：

4.6.1台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；

4.6.2流式细胞仪检测DC细胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表达以确

定DC是否成熟。

5.0DC-CIK细胞的制备和质检

5.1收集步骤4和步骤3中所获得的DC细胞和CIK细胞，按1:10(数目比)的比例

共培养，无血清培养液中添加重组人IL-2(300U/ml)；

5.2每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2(300U/ml)。

5.3在第7d收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；

5.4DC-CIK细胞的质检：

5.4.1台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；

5.4.2流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细

胞的比例应在20%以上。

5.4.3细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞

或肿瘤细胞株)为靶细胞，将效应细胞与靶细胞按10:1(数目比)的比例加入96孔U

型板中，每孔含靶细胞1x104个，终体积为200ml，设3个复孔。培养4h，然后

取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测效应细胞对靶细胞的杀伤率。

5.4.4收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，

及内毒素(标准：病原学检测阴性，内毒素<5Eu)。

注：AF即AnimalFree意为无动物成分。无动物成分的重组细胞因子在生产过程中不会有任何动

质，尤其是牛蛋白的混入，使得最终获得的重组人蛋白中不含任何动物成分。这样可避免动物病

牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的机体异种排斥和过敏反应，因此细胞治疗的体外细胞

中最好使用无动物成分的重组细胞因子。