上游引物

引物设计步骤

1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，

复制该编码序列到primer5中。

2、用PrimerPremier5搜索引物

①打开PrimerPremier5，点击File-New-DNAquence,出现输入序列窗口，Copy目的序

列在输入框内。点击Primer，进入引物窗口。

②点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCRprimers”，“Pairs”，设定搜索区域

和引物长度和产物长度。在SearchParameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需

要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，可以选择300～500bp.

③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认

按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引

物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。

④对于引物的序列，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如

GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70度之间，

GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以

下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交

叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即

可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮

都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽。

二、引物设计注意事项

普通引物

①PrimerLength设置在18－25bp。

②PCRProductsize最好是180－500bp之间。

③Searchstringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。

荧光引物见表