dna复制方向

DNA的复制机制

所有的生物体在每个细胞分裂之前必须以非同寻常的准确度复制其DNA。在这一部分,我们

将探索生物体内一个精巧的“复制机器”在以1000个核苷酸每秒的速度复制DNA的同时，

是如何达到这一准确度的。

碱基配对是DNA复制和DNA修复的基础

第一章已经简单讨论过,DNA模板化是一条DNA链（或选定的部分）的核苷酸序列通过碱

基互补配对(A与T,G与C)被拷贝出一条互补的DNA序列(Figure5-2）。该过程需要DNA

模板链中每个核苷酸被一个自由的（未聚合的)互补核苷酸识别，而且要求DNA螺旋的两

条链被分开。这一分开,使得每个DNA碱基上的氢键的供体或受体基团暴露出来，以便和进

来的合适的自由核苷酸配对，为其酶催化聚合为一条新DNA链校准。

Figure5-2DNA双螺旋作为自身复制的模板。因为核苷酸A只能和T成功配对,G之和

C，所以DNA的每条链都作为一个模板通过碱基配对来指定其互补链的核苷酸序列。这样，

一个双螺旋DNA分子可被精确复制。

第一个聚合核苷酸的酶，DNA聚合酶发现与1957年。作为该酶底物的自由核苷酸是三磷

酸脱氧核糖核苷,它们聚合为DNA要求一个单链模板.这一反应的逐步机制在Figures5-3和

5—4中说明。

Figure5-3DNA的合成化学

一个脱氧核糖核苷酸被加到一条多聚核

苷酸链（引物链）的3‘端是DNA合成

的基础反应。如图所示，一个新来的三磷

酸脱氧核糖核苷和一条存在的DNA链

（模板链)进行碱基配对,引导新DNA链

的形成，并且使之有一条互补核苷酸序

列。

Figure5-4由DNA聚合酶催化的DNA合成

（A）如图所示，DNA聚合酶催化一个脱氧核糖核苷酸向一条多聚核苷酸链（引物链，已

和另一模板链配对)的3‘—OH端的逐步添加。新合成的DNA链因此是以5‘—3’的方

向聚合的，正如前一幅图所示。因为每个新来的三磷酸脱氧核糖核苷必须和模板链配对以被

DNA聚合酶识别，模板链决定了哪种脱氧核糖核苷酸（A，T,C，或者G）将被添加。焦磷

酸盐的释放及其后续水解为两个无机磷酸盐分子导致巨大的有利的自由能改变，驱动了脱氧

核苷酸的添加反应.（B）一个由X—线晶体学确定的大肠杆菌DNA聚合酶分子结构。通俗

的讲,它就像一只右手,手掌手指和大拇指握住DNA.该图示例的是一个在DNA修复时起作

用的DNA聚合酶，但是复制DNA的酶有相似的特征。

DNA复制叉非对称

在细胞内DNA复制期间，每条旧DNA链都作为形成一条完整新链的模板.因为一个分裂细

胞的两个子细胞都遗传了包含旧链和新链的新DNA双螺旋（Figure5—5）,该DNA双螺

旋据说是被DNA聚合酶半保留复制。这一任务是如何完成的呢?

Figure5-5DNA复制的半保留性质

在一轮复制中，DNA的每条链都用左形成互补链的模板.原

始链因此经历很多代而完好无损。

1960年代早期对完全复制的染色体进行的分析发现，一个局部的复制区域沿母DNA双螺

旋向前移动。因其Y形结构该活跃区域被称为复制叉(Figure5—6）在复制叉处,两条新的子

链被一个包含DNA聚合酶在内的多酶复合物

合成。

Figure5—6在一个环形染色体上两个复制叉

朝相反方向移动.

一个活跃的DNA复制区域沿正在复制的DNA

分子向前移动,形成一个Y形DNA结构即复制叉:Y的两条臂是两个子DNA分子，Y的茎是

母DNA螺旋。图中，母链为橙色;新合成的链为红色。

DNA合成中不存在3‘—5’的DNA聚合，只有5‘—3'。

Figure5—7一种不正确的DNA复制

模型.虽然看起来像是最简单的DNA复

制模型，这里所示例的机制并非细胞使

用的。在这个方案中，两条子DNA链

都连续增长，利用两个末端磷酸(图中发

红光黄圈所示)水解的能量在每条链上

添加下一个核苷酸.这就要求链既以5

‘—3'方向增长也以3‘-5’方向增长.催化3‘-5'方向的核苷酸聚合的酶尚未发现。

那么,3‘-5’方向的总体链增长是如何实现的呢?答案是冈崎片段—-复制叉处短暂存在的

1000—2000个核苷酸长度的DNA碎片(真核生物中也有相似的复制中介，长度只有100

—200个核苷酸）。冈崎片段只以5‘-3’链方向被聚合而成，合成以后被连接在一起形成

连续的长DNA链。

复制叉因此具有一个不对成的结构(Figure5—8）.被连续合成的子链叫前导链,其合成稍微

领先于另一条非连续的合成子链，即后随链.后随链的核苷酸聚合方向和DNA链的总体增长

方向相反。后随链合成之所以要延迟，是因为必须等待前导链将合成冈崎片段的模板链暴露

出来。后随链通过一种不连续的“后缝”机制合成意味着DNA复制只需要5‘—3’类型

的DNA聚合酶。

Figure5—8DNA复制叉结构。因为两条DNA子链都以5‘—3’方向聚合，后随链上

的DNA合成开始时必须被做成一系列短的DNA分子，称为冈崎片段。

DNA复制的高保真要求几种校对机制

正如本章开始所述，复制期间拷贝DNA的保真度为每109个拷贝的核苷酸中大约有1个错

误.基于碱基互补配对的准确度，这一保真度比预期要高得多.标准的互补碱基配对对并非唯

一的互补配对形式，比如，在螺旋几何中一些小的变化，DNA中G和T之间即可形成两个

氢键。另外,四种DNA碱基会短暂出现稀少的互变异构体形式，比例为1比104或105.这

些互变异构形式不改变螺旋几何即可发生错配：例如，C稀少的互变异构形式与A相配，

而不是和G。

当新来的三磷酸脱氧核糖核苷和DNA模板发生错配时，如果DNA聚合酶不做什么特殊的

事，这个错误的核苷酸就会被包含在新DNA链中，产生频繁的变异。DNA复制的高保真

度不仅依靠互补配对，还依靠几种校对机制顺序执行以修正任何可能已经出现的初始错配。

第一个校对步骤,由DNA聚合酶在新核苷酸被加在增长链上之前执行。首先正确的核苷酸比

不正确的核苷酸对移动的聚合酶有更高的亲和力，因为只有正确的核苷酸睬可和模板正确配

对。此外，核苷酸键联之后,共价地添加到增长链上之前,DNA聚合酶必须进行一次构象改变。

一个不正确的核苷酸比正确的核苷酸更有可能在这一步脱离.这一步因此让聚合酶在催化添

加核苷酸之前两次检查准确的碱基配对几何。

下一步错误修正反应，核酸外切校对.DNA聚合酶不能通过连接两个三磷酸脱氧核糖核苷

来开始一条新多聚核苷酸链，而是绝对要求一条引物链已碱基配对的3‘-OH端来进一步

添加核苷酸（见Figure5—4).所以如果引物链3'—OH端的核苷酸错配了，DNA聚合酶就

不能延伸这样一条链。DNA聚合酶分子在一个分开的催化位点(根据具体的聚合酶，在该聚

合酶分子的一个分开的子单元或者分开的域里面）处理错配的引物链。进行校对的核酸外切

酶沿3‘-5‘方向切除掉引物链3'端任何未配对残基，直到足够的核苷酸被移除，重新生成

了一个碱基配对的3‘—OH端，可引导DNA合成。这样,DNA聚合酶又作为一个“自我

修正”酶，沿DNA移动时移除掉自己的聚合错误（Figures5—9和5-10）

Figure5-9DNA聚合酶在DNA复制期间的核酸外切校对。

在本例中，错配是因为包含了一个稀有的短暂的C碱基互变

异构体形式(星号所示）。同样的校对机制适用于在3‘-OH

端的任何其他错误包含的核苷酸。

Figure5-10DNA聚合酶和DNA模板络合物在聚合模式(A

左和编辑模式（右）下的结构略图。E为核酸外切反应的催

化位点,P为聚合反应的催化位点。

对完美配对的引物终端的要求对于DNA的自我修正性质是很重要的。DNA聚合酶在没有

引物的情况下开始合成，要完全正确区分配对的和未配对的3‘-OH端,很明显不可能.相反，

基因转录中的RNA聚合酶不需要有效的核酸外切校对：RNA中的错误把不会传给下一代，

偶尔的缺陷RNA分子无长期影响。因此RNA聚合酶可以无需引物即开始合成.

在RNA合成以及单独的mRNA翻译过程中，都发现了大约1/104的错误频率.这一水平比

DNA复制的错误率高100，000倍.是一系列校对过程使得DNA复制过程相当的准确（table

5-1）。

table5—1促进DNA高保真合成的三部曲。第三部，链指导错配修复，本章后续将介绍.

链指导错配修复系统移除复制错误移除从复制机器逃脱的

错误

正如前面所述,细菌如大肠杆菌能够每30分钟分裂一次，使得从大量菌株中筛选找出一个稀

有的在某一特定过程中发生改变的变种细胞相对容易。一个有趣的变种类型,包含了所谓增

变基因中的改变，增变基因大大增大了自发突变率，即使在它们未激活时。并不奇怪的是，

一个这样的变种所产生的的3‘—5’校对核酸外切酶（DNA聚合酶的一部分，见Figures

5-9和5—10)是有缺陷的形式.当3‘-‘5'的核酸外切酶校对有缺陷时，DNA聚合酶不再

有效率地校对，许多本来可以被移除的错误在DNA中累积起来。

对其他非正常高变异率的大肠杆菌变种的研究发现了另一种校对系统，该校对系统移除由

DNA聚合酶产生而被校对核酸外切酶错过的错误。链指导错配修复系统，检测DNA螺旋

中由于非互补碱基对不匹配而造成的潜在的扭曲。但是如果该校对系统仅仅识别新复制的

DNA中的错配，随机修正两个错配核苷酸中的一个,就可能错误地修正原始模板链来匹配错

误，因而不能降低总体错误率.为了有效,这样一个校对系统必须能够区分和移除新合成链上

的错配核苷酸，新合成的链才是错误发生的地方。

大肠杆菌中的错配校对系统所使用的链区分机制是依靠DNA中GATC序列中A残基的甲基

化.唯一未被甲基化的GATC序列位于紧随复制叉后面的新链中.新链和旧链的识别就是通过

未被甲基化的GATC的识别来实现的。链指导错配修复的三步过程包括：错配的识别，从

新链中切除包含错误的DNA片段，以旧链为模板重新合成被切除的片段——从而移除了错

配。链指导错配修复系统减少了DNA复制期间的错误数量，见table5-1.

真核生物中,在错配位点区分新链和模板母链的机制不是依靠DNA甲基化。事实上,有些真

核生物——包括酵母和果蝇——不会甲基化其任何DNA。新合成的链具有刻痕，生化专家

揭示了这些刻痕（也被称作单链裂口）在真核生物中为链指导错配修复系统提供了信号，指

导其去修复合适的链（新链）.

Figure5-23真核生物中的链指导错配修复模型

（A）Thetwoproteinsshownareprentinbothbacteriaandeucaryoticcells：MutSbinds

specificallytoamismatchedbapair,whileMutLscansthenearbyDNAforanick。Oncea

nickisfound,MutLtriggersthedegradationofthenickedstrandallthewaybackthroughthe

mismatch。Becaunicksarelargelyconfinedtonewlyreplicatedstrandsineucaryotes,

replicationerrorsarelectivelyremoved。Inbacteria，themechanismisthesame，except

thatanadditionalproteininthecomplex（MutH)nicksunmethylated(andthereforenewly

replicated)GATCquences,therebybeginningtheprocessillustratedhere。(B)The

oteinisadimer，whichgrips

theDNAdoublehelixasshown，sthat

theMutSproteinscanstheDNAformismatchesbytestingforsitesthatcanbereadilykinked,

whicharethowithoutanormalcomplementarybapair.（B，fromG。Obmolovaetal。，

Nature407:703–710，2000。©MacmillanMagazinesLtd.)

只有5‘-3’方向的DNA复制允许有效的错误修正

Figure5-11An

explanationforthe

5′-to—3′directionof

DNAchaingrowth

Growthinthe5′-to-3′

direction,shownonthe

right，allowsthechain

tocontinuetobe

elongatedwhena

mistakein

polymerizationhas

beenremovedby

exonucleolytic

proofreading（e

Figure5-9）。In

contrast，

exonucleolytic

proofreadinginthe

hypothetical3′-to—5′

polymerizationscheme，

shownontheleft,would

blockfurtherchain

convenience，onlytheprimerstrandoftheDNAdoublehelixisshown。

一种特殊的聚合核苷酸的酶在后随链上合成短RNA引物分

子

对于前导链，仅在复制开始时需要一个特殊的引物：一旦复制叉建立起了，DNA聚合酶就

将持续地面对一个配好对的链端以添加新核苷酸.然而,在复制叉的后随链上，DNA聚合酶每

次完成一条新的冈崎片段（几秒钟），必须在模板链更前方的位点开始合成一个全新的片段

(见Figure5—8).一个专门的机制产生DNA聚合酶所需的碱基配对的引物链.该机制包括一种

叫DNA引物酶的酶，用三磷酸核糖核苷酸在后随链上合成短的RNA引物（Figure5—12）.

在真核生物中,这些引物大约为10个核苷酸长度,在后随链上间隔100—200个核苷酸。

Figure5-12RNA引物合成

AschematicviewofthereactioncatalyzedbyDNA

prima,theenzymethatsynthesizestheshortRNA

primersmadeonthelaggingstrandusingDNAasa

DNApolymera,thinzymecan

startanewpolynucleotidechainbyjoiningtwo

nucleosidetriphosphatestogether。Theprima

synthesizesashortpolynucleotideinthe5′-to—3′

directionandthenstops，makingthe3′endofthis

primeravailablefortheDNApolymera。

因为DNA引物包含合适的碱基配对的具有3‘-OH

端的核苷酸，所以可被DNA聚合酶在该端延长，以

开始冈崎片段。当在DNA聚合酶遇到上一个冈崎片

段的RNA引物时，冈崎片段的合成即终止。为了将

这些DNA片段生成连续的DNA链，一个专门的DNA修复系统迅速行动，擦除旧的RNA

引物，以DNA代替之。最后，一种叫DNA连接酶的酶，将新DNA片段的3’端和上一个

片段的5‘端连接起来（Figures5-13和5-14）。

Figure5—13Thesynthesisofoneofthemany

DNAfragmentsonthelaggingstrand

Ineucaryotes,RNAprimersaremadeatintervals

spacedbyabout200nucleotidesonthelagging

strand,andeachRNAprimerisapproximately10

nucleotideslong。Thisprimeriradbyaspecial

DNArepairenzyme(anRNAH）thatrecognizesan

RNAstrandinanRNA/DNAhelixandfragmentsit；

thisleavesgapsthatarefilledinbyDNApolymera

andDNAliga。

Figure5-14ThereactioncatalyzedbyDNAliga

Thinzymealsabrokenphosphodiesterbond。Asshown，DNAligausamolecule

ofATPtoactivatethe5′endatthenick(step1）beforeformingthenewbond(step2).Inthis

way,theenergeticallyunfavorablenick-alingreactionisdrivenbybeingcoupledtothe

energeticallyfavorableprocessofATPhydrolysis.

专门的蛋白质在复制叉前面打开DNA双螺旋

为了DNA合成的推进，DNA双螺旋必须在复制叉前面被打开，这样新来的核苷酸才能和

模板链形成碱基对.DNA双螺旋在正常条件下非常稳定，试管中必须要接近沸水的温度才能

将两条链分开。只有当模板链已经从其互补链分离开来而暴露出来时，DNA聚合酶和DNA

引物酶才能拷贝DNA.两种蛋白质—-DNA解旋酶和单链DNA结合蛋白,帮助打开双螺旋从

而为DNA聚合酶提供合适的单链DNA模板来进行拷贝.

DNA解旋酶首先和DNA单链结合，通过水解ATP周期性地改变其自身形状，从而进行机

械运动，即推动自己沿DNA单链快速前移，当碰到双螺旋区时，继续前进，以1000个核

苷酸对每秒的速度将双螺旋撬开(Figures5—15和5—16）.

Figure5—15AnassayudtotestforDNA

helicaenzymes

AshortDNAfragmentisannealedtoalongDNAsingle

ble

helixismeltedasthehelicarunsalongtheDNA

singlestrand，releasingtheshortDNAfragmentina

reactionthatrequirestheprenceofboththehelica

idstep—wimovementof

thehelicaispoweredbyitsATPhydrolysis

Figure5—16Thestructureof

aDNAhelica

（A)Aschematicdiagramofthe

proteinasahexamericring。(B）

Schematicdiagramshowinga

DNAreplicationforkandhelica

toscale。（C）Detailedstructure

ofthebacteriophageT7replicativehelica，asdeterminedbyx-raydiffraction。Sixidentical

subunitsbindandhydrolyzeATPinanorderedfashiontopropelthismoleculealongaDNA

icatesboundATPmoleculesinthe

structure.

单链DNA结合(SSB）蛋白，非常合作地紧紧结合在暴露出来的DNA单链上,而不覆盖其要做模板的碱基.

这些SSB蛋白不能直接打开一个长DNA螺旋，但是它们通过稳定被解开的单链构象来辅助解旋酶。另外，

它们合作性的结合,使模板上的单链DNA区段“穿上外套“并伸直，从而阻止在单链DNA中极容易形成

的短的发夹螺旋的形成（Figures5-17和5—18).发夹螺旋阻碍DNA聚合酶催化的DNA合成。

Figure5-17Theeffectofsingle-strandDNA—bindingproteins(SSBproteins)on

thestructureofsingle—strandedDNA

Becaueachproteinmoleculepreferstobindnexttoapreviouslyboundmolecule，long

rowsofthisproteinformonaDNAsinglestrand。Thiscooperativebindingstraightensoutthe

“hairpinhelices”shownin

thebare,single—strandedDNAresultfromachancematchingofshortregionsof

complementarynucleotidequence;theyaresimilartotheshorthelicesthattypicallyformin

RNAmolecules（eFigure1—6）.

Figure5—18Thestructureofthesingle—strandbindingproteinfromhumans

boundtoDNA

（A)AfrontviewofthetwoDNAbindingdomainsofRPAprotein,whichcoveratotalofeight

nucleotides。NotethattheDNAbasremainexpodinthisprotein–DNAcomplex。(B）A

diagramshowingthethree—dimensionalstructure，withtheDNAstrand(red）viewed

end—on.

移动的DNA聚合酶分子通过一个滑环与DNA保持连接

DNA聚合酶分子本身只会合成一条短的核苷酸串，就从DNA模板上掉下来。这一快速从DNA分子分离

的趋势，使得后随链上刚完成一个冈崎片段合成的DNA聚合酶分子被迅速回收，从而开始同一条链下一

个冈崎片段的合成。然而，如果不是一个附属蛋白的调节钳作用，这一快速分离将会使DNA聚合酶合成

长的DNA链非常困难.当DNA聚合酶移动时，这个钳子将其牢固地保持在DNA上,一旦遇到前方的双链

区段时就释放之.

这个钳子是如何在阻止聚合酶分离的同时而不阻碍其沿DNA分子快速移动的呢?X-线衍射确定的该钳蛋白

的三维结构，揭示了它环绕DNA螺旋形成一个大环。环的一边结合DNA聚合酶的后面，当聚合酶移动时，

整个环沿DNA自由滑动。这个钳环绕DNA的组装需要ATP水解。一种专门的蛋白质复合物,夹钳装载机,

在引物-模板连接处装载夹钳时,水解ATP（Figure5-19）.

Figure5—19TheregulatedslidingclampthatholdsDNApolymeraonthe

DNA

(A）,asdeterminedbyx—raycrystallography,

withaDNAhelixaddedtoindicatehowtheproteinfitsaroundDNA.(B）Asimilarproteinis

prentineucaryotes，idingclamp（left)with

thePCNAproteinfromhumans(right)。(C）Schematicillustrationshowinghowtheclampis

implifiedreaction

shownhere，theclamploaderdissociatesintosolutiononcetheclamphasbeenasmbled.

Atatruereplicationfork,theclamploaderremainsclotothelagging—strandpolymera,

readytoasmbleanewclampatthestartofeachnewOkazakifragment

在前导链模板上，移动的DNA聚合酶与夹钳长时间仅仅结合。但是,在后随链上,每当聚合酶到达上一个冈

崎片段的5‘端时，聚合酶就被释放了;然后这个聚合酶分子去和在下一个冈崎片段的RNA引物处组装的

新夹钳结合（Figure5-20)。

Figure5-20AcycleofloadingandunloadingofDNApolymeraandtheclamp

proteinonthelaggingstrand

Theassociationoftheclamploaderwiththelagging-strandpolymerashownhereisfor

illustrativepurposonly;inreality，theclamploaderiscarriedalongwiththereplicationfork

inacomplexthatincludesboththeleading—strandandlagging-strandDNApolymeras

（eFigure5-22）.

复制叉处的蛋白质相互协作形成一个复制机器

进行DNA复制的大多数蛋白质都在一起形成一个大型的多酶复合物，沿DNA快速移动。这个复合物，就

像一个由多个蛋白质部件组成并由三磷酸核苷水解提供动力的微型缝纫机。虽然这个复制复合物在大肠杆

菌及其几种病毒中研究的最多，真核生物中也有非常相似的复合物在运作,如下所示。

ThefunctionsofthesubunitsofthereplicationmachinearesummarizedinFigure5—21。Two

DNApolymeramoleculesworkatthefork，oneontheleadingstrandandoneonthe

laggingstrand。TheDNAhelixisopenedbyaDNApolymeramoleculeclampedonthe

leadingstrand，actinginconcertwithoneormoreDNAhelicamoleculesrunningalongthe

peningisaidedbycooperativelyboundmoleculesof

single—stheDNApolymeramoleculeontheleading

strandcanoperateinacontinuousfashion，theDNApolymeramoleculeonthelagging

strandmustrestartatshortintervals,usingashortRNAprimermadebyaDNAprima

molecule.

Figure5—21TheproteinsatabacterialDNAreplicationfork

ThemajortypesofproteinsthatactataDNAreplicationforkareillustrated,showingtheir

approximatepositionsontheDNA.

所有这些蛋白质组件紧密联系,大大提高了复制的效率。在原核生物中，DNA引物酶直接和DNA解旋酶相

连,在后随链上形成一个叫引发体的单元。在DNA解旋酶的驱动下，引发体随复制叉移动，一边走一边合

成RNA引物.相似地,在后随链上合成DNA的DNA聚合酶分子和其他蛋白质协作，移动,合成一系列冈崎

片段。为了迁就这样的安排,后随链似乎以Figure5-22所示的方式折叠起来。这一安排也促进了每次冈崎

片段合成之后聚合酶夹钳蛋白的加载：夹钳加载机和后随链DNA聚合酶分子保持在一起，作为蛋白质机

器的一部分,即使它们已从DNA上卸下.复制蛋白质因此被连在一起形成一个沿DNA快速移动的单个大型

单元(总分子质量〉106Da），使DNA在复制叉两边以一种协调高效的方式被合成。

Figure5—22Amovingreplicationfork

（A)Thisschematicdiagramshowsacurrentviewofthearrangementofreplicationproteins

atareplicationforkwhentheforkismoving。ThediagraminFigure5-21hasbeenalteredby

foldingtheDNAonthelaggingstrandtobringthelagging—strandDNApolymeramolecule

intoacomplexwiththeleading-strandDNApolymeramolecule。Thisfoldingprocessalso

bringsthe3′endofeachcompletedOkazakifragmentclotothestartsiteforthenext

Okazakifragment(comparewithFigure5-21).Becauthelagging-strandDNApolymera

moleculeremainsboundtotherestofthereplicationproteins，itcanbereudtosynthesize

diagram，itisabouttoletgoofitscompletedDNA

fragmentandmovetotheRNAprimerthatwillbesynthesizednearby，asrequiredtostartthe

nextDNAfragment。NotethatonedaughterDNAhelixextendstowardthebottomrightand

theothertowardthetopleftinthisdiagram。Additionalproteinshelptoholdthedifferent

proteincomponentsoftheforktogether,enablingthemtofunctionasawell-coordinated

proteinmachine。Theactualproteincomplexismorecompactthanindicated，andtheclamp

loaderisheldinplacebyinteractionsnotshownhere。（B）Anelectronmicrographshowing

thereplicationmachinefromthebacteriophageT4asitmovesalongatemplatesynthesizing

DNAbehindit。(C)Aninterpretationofthemicrographisgiveninthesketch：noteespecially

ntly,thereplicationproteinsbecamepartly

detachedfromtheveryfrontofthereplicationforkduringthepreparationofthissamplefor

electronmicroscopy.

在后随链上，DNA复制机器留下了一系列未缝补的冈崎片段，其中还含有位于冈崎片段5‘端的引导其合

成的RNA。进行DNA修复的酶在复制叉之后进行操作，移除这些RNA，并填补由此产生的沟（见Figure5

—13）。

DNA拓扑异构酶在DNA复制期间阻止DNA纠结

当复制叉沿双链DNA移动时，会造成一个所谓的“缠绕问题“。每10个碱基对对应于一个绕双螺旋轴的

完整的转向，即360°。因此一个复制叉移动时,叉前方的整个染色体都将不得不快速旋转（Figure5-24）。

这就需要大量的能量，所以采用了一种替代策略：DNA拓扑异构酶在DNA螺旋中形成一个旋转轴.

Figure5—24

The“windingproblem”thatarisduringDNAreplication.

Forabacterialreplicationforkmovingat500nucleotides

percond

，

theparentalDNAhelixaheadofthefork

mustrotateat50revolutionspercond.

DNA拓扑异构酶可看做是一种可逆的核酸酶，它将自己共价地加

载DNA骨架的磷酸上，从而断开DNA链中相应的磷酸二酯键.这一反应是可逆的，当该蛋白质离开时，

磷酸二酯键重新形成。

拓扑异构酶I，生成一个短暂的单链端口（或刻痕），使DNA双螺旋在断口两边的两部分可以用刻痕对面

的磷酸二酯键作旋转点相对于对方自由旋转（Figure5—25）。所以DNA复制只须一小段长度螺旋的旋转

——复制叉前方的一部分。DNA转录中出现的类似的缠绕问题也是以相似的方式解决的。因为DNA拓扑

异构酶和DNA磷酸之间的共价连接保持了断裂的磷酸二酯键的能量，磷酸二酯键的重新形成很快而且不

需要额外的能量输入。从这一点来说，DNA拓扑异构酶的重连机制和前面讨论过的DNA连接酶所催化的

连接机制是不同的（见图Figure5-14)。

Figure5-25Thereversiblenicking

reactioncatalyzedbya

eucaryoticDNAtopoisomeraI

enzyme

Asindicated,theenzymestransiently

formasinglecovalentbondwithDNA;

thisallowsfreerotationoftheDNA

aroundthecovalentbackbonebonds

linkedtothebluephosphate.

DNA拓扑异构酶II，同时对DNA螺旋的两

条链形成共价连接,形成一个短暂的双链断裂。该酶被染色体上双链交叉的位点激活。一旦拓扑异构酶II结

合到这样一个交叉位点，该蛋白质就用ATP水解来高效地进行下面的反应：1)可逆地断开其中一个双螺旋，

形成一个“门“;2）让另一个双螺旋通过这个断口;3）重新密封断口，离开DNA(Figure5-26）。这样,II

型DNA拓扑异构酶可有效分离两个互锁的DNA环（Figure5—27)。

Figure5-26AmodelfortopoisomeraIIaction

Asindicated,ATPbindingtothea

singlecycleofthisreactioncanoccurintheprenceofanon—hydrolyzableATPanalog,ATPhydrolysisisthoughttobe

delisbadonstructuralandmechanisticstudiesofthe

enzyme。

Figure5-27TheDNA-helix—passingreaction

catalyzedbyDNAtopoisomeraII

IdenticalreactionsareudtountangleDNAinsidethecell.

UnliketypeItopoisomeras，typeIIenzymesuATP

hydrolysisandsomeofthebacterialversionscanintroduce

superhelicaltensionintoDNA。TypeIItopoisomerasare

largelyconfinedtoproliferatingcellsineucaryotes;partlyfor

thatreason,theyhavebeenpopulartargetsforanticancer

drugs。

该反应防止了否则会在DNA复制期间出现的严重的DNA缠结问题。一种变异的酵母细胞

很好地说明了这一作用。这种变异酵母细胞不是产生正常的DNA拓扑异构酶II，而是产生

一种在37℃失活的版本。当这种变异细胞被加热到37℃时,它们在DNA复制以后,子染色

体缠绕在一起,无法分离。

DNA复制在真核生物中和细菌中相似

我们所了解的关于DNA复制的许多知识都是首先从对能够离体复制DNA的纯化细菌和噬菌体多酶系统的

研究中获得的。第一个在体外准确复制DNA的哺乳动物复制系统出现在1980年代中期，在酿酒酵母中编

码几乎全部复制组件的基因的变异现在已经被分离出来并进行了分析。所以,已经知道了大量关于真核生物

DNA复制的详细酶学知识.而且已经清楚了，DNA复制的基本特征—-包括复制叉几何以及多蛋白复制机

器的使用-—在将细菌和真核生物分开的漫长进化历程中是守恒的。

真核生物的复制机器有比细菌的有更多的蛋白质组件，即使基本功能一样。比如，真核生物的SSB蛋白由

3个子单元形成，而细菌中只发现了一个。相似地，DNA引物酶被包含在一个叫DNA聚合酶α的多子单

元酶中。DNA聚合酶α在后随链上以RNA开始每个冈崎片段,然后以一小段DNA延伸RNA引物，才将该

引物的3‘端传给DNA聚合酶δ（即上文所述的，在夹钳蛋白滑环的帮助下合成冈崎片段的DNA聚合酶）。

（Figure5-28）

Figure5—28Amammalianreplicationfork

TheforkisdrawntoemphasizeitssimilaritytothebacterialreplicationforkdepictedinFigure

5—21。Althoughbothforksuthesamebasiccomponents，themammalianforkdiffersin

，itustwodifferentDNApolymerasonthelagging

,themammalianDNAprimaisasubunitofoneofthelagging—strandDNA

polymeras,DNApolymeraα，whilethatofbacteriaisassociatedwithaDNAhelicain

ymeraα(withitsassociatedprima）beginschainswithRNA，

extendsthemwithDNA，andthenhandsthechainsovertothecondpolymera(δ）,which

tknownwhyeucaryoticDNAreplicationrequirestwodifferent

polymerasonthelaggingstrand。ThemajormammalianDNAhelicaemstobebad

onaringformedfromsixdifferentMcmproteins；thisringmaymovealongtheleading

strand，ratherthanalongthelagging—strandtemplateshownhere。

下一部分我们将会看到，真核生物的复制机制因为不得不经过核小体而增大了复杂性。核小体是

染色体的重复结构单元。核小体以大约200个核苷酸对沿DNA分布，这可能解释了为什么真

核生物中后随链上的冈崎片段以100—200个核苷酸的间隔合成,而不是像细菌那样的1000—

2000个核苷酸间隔。核小体可能还是减慢DNA聚合酶分子移动速度的障碍，这可能是真核生

物复制叉移动速度只有细菌复制叉的十分之一的原因。

总结

DNAreplicationtakesplaceataY—shapedstructurecalledareplicationfork.A

lf—correctingDNApolymeraenzymecatalyzesnucleotidepolymerizationina5′—to—3′

direction，hetwostrandsofa

DNAdoublehelixareantiparallel,this5′—to—3′DNAsynthesiscantakeplacecontinuously

ononlyoneofthestrandsatareplicationfork(theleadingstrand)。Onthelaggingstrand,

shortDNAfragmentsmustbemadebya“backstitching”ethe

lf—correctingDNApolymeracannotstartanewchain，thelagging-strandDNA

fragmentsareprimedbyshortRNAprimermoleculesthataresubquentlyeradand

replacedwithDNA。

DNAreplicationrequiresthecooperationofmanyproteins。Theinclude(1）DNA

polymeraandDNAprimatocatalyzenucleosidetriphosphatepolymerization;（2）DNA

helicasandsingle—strandDNA—binding(SSB)proteinstohelpinopeninguptheDNA

helixsothatitcanbecopied;(3)DNAligaandanenzymethatdegradesRNAprimersto

altogetherthediscontinuouslysynthesizedlagging-strandDNAfragments；and(4）DNA

tothe

proteinsassociatewitheachotheratareplicationforktoformahighlyefficient“replication

machine,”throughwhichtheactivitiesandspatialmovementsoftheindividualcomponents

arecoordinated.