断裂基因

颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA

———颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径①

李先茂 曾位森② 张亚历 (第一军医大学南方医院消化病研究所,广州510515

)

中国图书分类号 R392111 文献标识码 A 文章编号 10002484X(204

[摘 要] 目的:颗粒酶B

(

GranzymeB,GraB

)对核内物质具亲和力,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GraB聚积,观

察GraB是否直接作用于基因组DNA。方法:通过抽提人外周血淋巴细胞总RNA,进行RT2PCR克隆GraBcDNA,构建GraB原核

表达载体,用限制性酶切和DNA测序进行鉴定;异丙基212硫代2

β

2呋喃半乳糖苷(

IPTG

)诱导表达,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳

(

SDS2PAGE

)分析表达产物。表达产物经亲和层析纯化后,观察其对基因组DNA的功能。

结果:表达产物以可溶性分子形式存

在于菌体中,具有良好的抗原性和特异性,特异性底物检测有活性,且具有直接作用于部分断裂的基因组DNA,使其发生进一

步裂解的活性。结论:GraB直接作用于部分断裂的基因组DNA,这可能是GraB诱导细胞凋亡新的作用途径。

[关键词] 颗粒酶B;基因克隆;原核表达;凋亡

GraBworkdirectlyonthegenomeDNAfragments

LIXian2Mao,ZENGWei2Shen,tititueofGastroenterology,NanfangHospital,theFirstMilitary

MedicalUniversityofPLA,Guangzhou510515,China

[Abstract] Objective:rthepurpoofinvestionofitsfunctionon

s:fiedwithendonuclea

cutandDNAquenceanalysis,pressionvectorpTrcHis2A,thepokaryoticexpressionplasmidpTrcHis2AΠ

s:After8hofIPTGinduction,theGraBwaxpresd15%oftotalproteinsby

nblotassayombinantproteinpurifiedby

sfoundtoworkdirectlyonthegenomeDNAfragments,2

clusion:ItisfoundthattheremayexistcertainnovelpathwayforGraB2inducedapoptosis.

[Keywords] GraB;Genecloning;Geneexpression;Apoptosis

GraB是杀伤性淋巴细胞内杀伤颗粒特有的丝

氨酸蛋白酶。它是细胞介导的细胞毒作用中重要的

效应分子,在抗病毒免疫、肿瘤免疫、自身免疫和移

值免疫等方面都发挥极为重要的作用。GraB除在

胞浆中激活caspas级联反应启动凋亡外,还可直

接迁移至细胞核,切割NuMA和PARP

(体外、体内)、

DNA2PKcs

(体外)等一系列核蛋白,启动或促进核凋

亡事件。GraB对核内物质具亲和力,体外除去核膜

的细胞核中可观察到大量GraB聚积1。我们观察

GraB能否直接作用于基因组DNA。

1 材料与方法

111 材料 原核表达载体pTrcHis2A及宿主菌

①本课题受国家自然科学基金(

39870723

)

,广东省组织工程团队项

目资助

②第一军医大学细胞生物教研室,广州510515

作者简介:李先茂(

1972年-

)

,男,博士;

指导教师:曾位森,男,讲师,主要从事肿瘤细胞的凋亡研究工作。

Top10F购自Invitrogen公司。大肠杆菌HB101、Jurkat

细胞株由南方医院消化科保存。限制性内切酶、

T4DNA连接酶、PfuDNA聚合酶、MMLV、dNTP、DTT、

丙烯酰胺和双叉丙烯酰胺均购自Promega公司;GraB

单抗购自Dako公司;Trizol试剂、TalonMetalAffinity

Resins购自Clontech公司;GraB的底物Z2Ile2Glu2Thr2

Asp2AFC购自Calbiochem公司。

112 方法 取正常成人外周血,用淋巴细胞分离液

进行分离,Trizol试剂提取细胞总RNA经RT2PCR获

得GraBcDNA,所用引物序列如下:上游引物:TAG2

GATCCATCATCGGGGGACATGAGG;下游引物:TA2

AAGCTTTAGTTAGTAGCGTTTCATG。反转录反应的

体积为25

μ

l,含10×Buffer215

μ

l,细胞总RNA5

μ

g,

4×dNTP1molΠL,六核苷酸随机引物10pmol,RNasin

10U,MMLV逆转录酶50U,42℃反应1小时。取反

转录产物3

μ

l为模板做PCR。GraB的PCR反应体

系为50

μ

l,含10×PfU酶Buffer5

μ

l,4×dNTP200

μ

molΠL,上下游引物各1

μ

molΠL,PfUDNA聚合酶

・818・中国免疫学杂志2003年第19卷

3U。循环参数为94℃30秒,58℃30秒,72℃1分

钟,30个循环。GraB原核表达载体的构建:用限制

性内切酶分别消化GraBRT2PCR产物和原核表达载

体框架pTrcHis2A,经琼脂糖凝胶电泳,回收相应片

段,以T4DNA连接酶,16℃连接12～16小时,转化

HB101,经碱法小量抽取质粒,并用限制性酶切和

DNA序列测定进行鉴定。将构建好的pTrcHis2AΠ

GraB转化TOP10F,37℃培养过夜,挑取单菌落于LB

液体培养基(

50gΠL氨苄青霉素)

5ml中,37℃恒温

摇床300rΠmin,培养至A=015～016,加IPTG30℃继

续培养8小时,取1ml以4℃6000rΠmin离心进行

鉴定。GraB表达产物的SDS2PAGE分析:取离心沉

淀1ml菌液加入1×SDS2PAGE上样缓冲液,置沸水

中煮10分钟,加样于12%的聚丙烯酰胺凝胶进行电

泳,约2小时后进行考马斯亮蓝染色。凝胶用薄层

扫描仪扫描,计算重组蛋白占大肠杆菌可溶性蛋白

的百分比。免疫学鉴定:表达产物采用Westernblot

进行分析,具体步骤参见文献2进行。GraB的纯

化:用裂解液(

50mmolΠLPBS,300mmolΠLNaCl

)悬浮

细菌,超声破碎离心取上清,加入装有TalonMetal

AffinityResins的柱子。用013molΠLNaCl冲洗,再加

0115molΠL咪唑洗脱,行PBS缓冲液透析。纯化蛋

白行SDS2PAGE并用薄层扫描仪扫描计算重组蛋白

的纯度。GraB活性鉴定在荧光分光光度仪下检测

表达的GraB

(溶于PBS

)与带荧光标记的GraB底物

(

1mgΠml

)结合时荧光强度,对照组为等质量的带荧

光标记的GraB底物(溶于PBS

)。GraB对基因组

DNA的作用LOVO细胞于1640培养基中37℃、5%

CO

2

条件下培养,酚氯仿法抽提LOVO细胞基因组

DNA,超声破碎基因组DNA。部分断裂基因组DNA

与GraB,或与10

μ

lPBS共同37℃孵育3小时,琼脂

糖凝胶电泳观察结果。

2 结果

211 GraB的克隆 RT2PCR产物电泳741bp处得

到相关片段(见图1

)。GraB原核表达载体的构建

(见图2

)。采用Sanger法测序结果显示插入的GraB

基因方向正确、无碱基错误和缺失。对菌体和上清

的SDS2PAGE分析结果显示,上清无特异条带产生;

IPTG诱导的菌体超声破碎上清蛋白,在27ku处有

一条带明显的区别于未加IPTG诱导的菌体对照组,

这与GraB分子量基本一致,而且GraB表达量占菌

体总蛋白15%以上,纯化蛋白的纯度在80%以上

(见图3

)。

Westernblot结果显示,GraB表达菌体在27ku

处有一条特异性条带,IPTG诱导表达的菌体的GraB

表达量明显比未用IPTG诱导表达的多,证实表达产

物具有GraB的抗原性(见图4

)。生物学活性检测

显示表达的GraB

(溶于PBS

)与带荧光标记的GraB

底物(

1mgΠml

)结合时荧光强度明显增强,1

μ

g表达

的GraB的荧光强度增强9169±0113。

212 GraB对基因组DNA的作用 部分断裂基因组

DNA经重组GraB消化后进一步裂解,且具有剂量依

赖性。

21211 GraB对断裂基因组DNA的作用见图5。

21212 不同剂量GraB对断裂基因组DNA的作用见

图6。

图1 RT2PCR产物电泳图

Fig.1 PT2PCRproductelectrophoresisresult

图2 颗粒酶B原核表达载体的构建

Fig.2 ConstructionofrecombinantplasmidpTrcHis2AΠGraB

・918・李先茂等 颗粒酶B直接裂解部分断裂的基因组DNA———颗粒酶B诱导细胞凋亡新途径 第12期

图3 重组蛋白GraB的SDS2PAGE分析

Fig.3 SDS2PAGEanalysisofrecombinantprotein

Note:11IPTG2induce8h;protein;2induced;2induce

12h;2induce18h;rdrelativemolecularmass

(

M

r

)

marker.

图4 重组蛋白GraBWesternblot分析

Fig.4 Westernblotanalysisofrecombinantprotein

Note:2induced;duced.

图5 重组蛋白GraB裂解断裂基因组DNA

Fig.5 RecombinantGraBsplitgenomeDNAfragment

Note:k;21genomeDNAfragmentand012

μ

gGraB;31genome

DNAfragmentand10

μ

lPBS;41genomeDNAand012

μ

gGraB;2

nomeDNA.

图6 不同剂量GraB对断裂基因组DNA的作用

Fig.6 GraBsplitgenomeDNAfragmentwithdifferentdo

Note:11DNAmark;21018

μ

gGraBandgenomeDNAfragment;31014

μ

g

GraBandgenomeDNAfragment;41012

μ

gGraBandgenomeDNA

fragment;51011

μ

gGraBandgenomeDNAfragment;610105

μ

gGraB

andgenomeDNAfragment;k.

3 讨论

杀伤细胞识别靶细胞后,排放其特有的杀伤颗

粒,诱导靶细胞凋亡。杀伤颗粒中的主要成分是颗

粒酶(

granzyme

)和穿孔素(

perforin

)。颗粒酶中GraB

是最主要的效应分子。GraB进入细胞后通路何种

信号转导通路诱导细胞凋亡也还不完全清楚。现有

的资料显示,GraB可以在细胞质、线粒体和细胞核

三个层次作用于不同的分子诱导细胞凋亡。最早发

现它能激活caspa3

(

CPP32

)。GraB能水解CPP32

酶原P32,使之转变成有活性的CPP32,从而使细胞

走向凋亡。另外,GraB也可能作用于caspa家族的

其他成员,如caspa8、ICE2LAP3等。但用caspa抑

制剂阻断caspa通路后,GraB仍能使细胞裂解325。

GraB还作用于线粒体的内膜,破坏线粒体的结构,

而且不依赖于caspa的活性。近来同时有两个实

验室报道,GraB可以直接酶解bid和Bax等,启动细

胞色素C的释放,而且这种途径勿需激活

caspa628。GraB除在胞浆中激活caspa级联反应

启动凋亡外,还可直接迁移至细胞核,切割NuMA和

PARP

(体外、体内)、DNA2PKcs

(体外)等一系列核蛋

白,启动或促进核凋亡事件。最近EhsanSharif2Asari

的研究提示,GraB在caspa通路被抑制后,能作用

于细胞核内的DFF45

(

DNA断裂因子45

)

,从而降解

基因组DNA9。进一步发现基因敲除DFF45的小

鼠细胞,当用caspa抑制剂阻断caspa通路后,

(下转第824页)

・028・中国免疫学杂志2003年第19卷

的作用。TNF2

α

可以通过活化Fas引起心肌细胞内

IP

3水平增高,诱导其细胞凋亡,但是IL21不具有诱

导其细胞凋亡的作用9。在感染性休克发生的过程

中,血管功能,特别是血管平滑肌舒缩功能起着重要

作用。Ⅰ型和Ⅲ型IP

3受体主要存在于血管壁细胞

内,尤其是血管平滑肌细胞10。众所周知,感染性

休克发生时,患者血清中许多血管活性物质明显增

高,这些物质是导致感染性休克循环衰竭发生的主

要原因11。血管活性物质,如内皮素、血管紧张素

Ⅱ和血管加压素等均能促进细胞内Ca2+释放,引起

细胞收缩。其主要机制是刺激细胞内IP

3水平增

高。当IP

3与IP

3受体结合后,促进细胞内钙释放。

本研究发现IL21

β

诱导了主动脉平滑肌细胞内Ⅰ型

IP

3受体蛋白表达增加。过度表达的Ⅰ型IP

3受体

为主动脉平滑肌细胞内储备Ca2+大量释放提供了

可能性。由于IL21

β

不影响I型IP

3受体mRNA半衰

期,其作用机制主要是通过诱导Ⅰ型IP

3受体mRNA

过度表达来增加Ⅰ型IP

3

受体蛋白表达,而Ⅰ型IP

3

受体mRNA过度表达可能是由于IL21

β

作用于IP

3

受体基因启动子的结果。感染性休克的发生是由于

血管收缩和舒张功能异常所致,而血管平滑肌细胞

内Ca2+水平高低与动脉的舒缩功能直接相关。所

以,主动脉平滑肌细胞内I型IP

3受体蛋白表达增

加,可能是血管活性物质引起细胞内储备Ca2+迅

速、大量释放入细胞浆,导致血管舒缩功能异常,引

起血液循环发生异常的病理生理基础。

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223

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[收稿2003201225 修回2003203219

(编辑 徐 杰)

(上接第820页)

GraB仍能使细胞裂解,这提示GraB仍有其它信号

转导通路诱导细胞凋亡。GraB对核内物质具亲和

力,体外除去核膜的细胞核中可观察到大量GraB聚

积1。我们的实验证实,GraB能直接作用于部分断

裂的基因组DNA,使其发生进一步裂解,这可能是

GraB诱导细胞凋亡的新途径。

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[收稿2002210229

(编辑 许四平)

・428・中国免疫学杂志2003年第19卷