gRNA

CRISPR技术操作指南

十年前，当研究人员开始解析细菌和古细菌中一个称为CRISPR

结构的时候，他们并没有预料到这会给基因编辑世界带来一场风暴。

在过去的这一年半时间里，CRISPR方法已迅速席卷了整个动物王

国，成为DNA突变和编辑的一种“马上”技术——迄今为止在几乎每

种实验细胞类型中都能起作用，包括人类细胞，小鼠，斑马鱼和果蝇

细胞；这种技术也易于操作，已经有两个研究组利用CRISPR分析

了人类细胞中几乎每个基因单突变（详细报道Science：

CRISPR/Cas9加速基因挖掘；Science：张峰建立CRISPR/Cas9

人细胞敲除体系）。就在最近，CRISPR还帮助研究人员完成了携

带特殊基因中断（genedisruptions）的工程猴，这项壮举此前曾在

小鼠中实现过，但未在灵长类动物中完成过（详细报道Cell：中国

科学家利用CRISPR/Cas9技术构建基因工程猴）。

CRISPR本身是一种防御系统，用以保护细菌和古细菌细胞不

受病毒的侵害。在这些生物基因组中的CRISPR位点能表达与入侵

病毒基因组序列相匹配的小分子RNA。当微生物感染了这些病毒中

的一种，CRISPRRNA就能通过互补序列结合病毒基因组，并表达

CRISPR相关酶，也就是Cas，这些酶都是核酸酶，能切割病毒

DNA，阻止病毒完成其功能。

将CRISPR/Cas系统用于其它非细菌细胞需要满足两个条件：

一个Cas酶，用于切断靶标DNA，比如目的基因中的DNA片段，

另外一个就是称为导向RNA（gRNA）的RNA分子，这种分子能

通过互补结合靶标。gRNA也就是细菌细胞中CRISPRRNA的一

个更短的版本，它能与Cas形成复合物，指导Cas到达正确的剪

切位点。不过研究人员也可以通过结合其它元件，或者改变Cas活

性，来调整这种工具在基因校正和基因调控方面的作用。

“目前，非传统基因编辑应用方面的生物学家利用一种新工具，

分析细胞中，和整个生物机体中突变的作用”，来自加州大学伯克利

分校的生物化学教授JenniferDoudna表示，她与她的同事解析了细

菌细胞中CRISPR的作用机制。近期，Doudna研究组利用这种工

具，首次通过小鼠受精卵基因编辑构建了敲除小鼠。

不过CRISPR技术也存在一个主要的缺点，那就是缺乏特异

性：一些gRNA分子结合的DNA只是部分与gRNA互补。在这

一方面，其它基因编辑方法，如锌指核酸酶（ZFN）和TALENS可

能要比Cas-gRNA更为具有优势，因为这两者需要识别更长的靶

标DNA序列。但是ZFN和TALENS方法在克隆和细胞表达方面

要比gRNAs难得多，而且研究人员通常还需要验证十几个不同的

TALENS，以及几十个不同的ZFNs，来证明其中一个有效。

近期《科学家》（TheScientist）杂志汇总了基因编辑过程中Cas

和gRNA的处理过程及解决方案，用于帮助新接触这一技术的研究

人员熟悉这项热门技术。

如何CRISPR我的靶标？

由于CRISPR系统并不复杂，因此我们所要做的就是将带有质

粒（能表达Cas和gRNA）的细胞进行转染。研究人员可以采用一

种Cas的变体，即Cas9，这种酶来自于一种链球菌，由RNA进

行指引，能无需其他蛋白的帮助而切割DNA（Science,337:816-21,

2012）。Cas9既能切断与gRNA结合的DNA链，也能切断其互

补链。目前可以从Addgene购买Cas9质粒（65美元），将其直

接转染入细胞。

gRNA的长度约为80个核苷酸，包含两个区域：gRNA5'端

前20个核苷酸对应于靶标DNA，能结合在靶标DNA上，剩余的

约60个核苷酸（gRNA长度取决于表达gRNA的质粒）形成一个

发夹结构，这个结构能帮助gRNA与Cas9结合，并由此指导与

DNA的结合。

gRNA与Cas9一样，也是通过质粒表达的，从Addgene可

以购买几种这种质粒（65美元），但是与Cas9不同的是，我们需

要自己定制与靶标相匹配的表达质粒。我们可以设计一个编码20个

碱基，与靶标DNA结合的片段，将其克隆进表达质粒里（编码

gRNA其它部分的60个核苷酸已经在质粒中了）。唯一的设计要求

就是，gRNA上要有一个片段，能与由任意核苷酸序列（N）+5'末

端两个胞嘧啶核苷酸（-NCC）的DNA结合。这是因为gRNAs似

乎与相对链包含两个鸟嘌呤残基（-NGG）的DNA片段结合最好，

这种-NGG序列也就是PAM结构（protospaceradjacentmotif）。

要在靶标DNA区域中挑选合适的20个碱基对，有几个方案可以

选择，比如麻省理工学院的CRISPRDesign（）；德

国癌症研究中心开发的E-Crisp

（/E-CRISP/designcrispr）；还有ZiFiTtargeter

（/ZiFiT/ChoiceMenu）。另外也可以筛选整个基因

组，找到与你的靶标位点相似的其它位点。

其中只有CRISPRDesign和E-Crisp可以预测哪些gRNA

序列特异性最强，ZiFiT不具有这种功能。但是由于这些预测位点周

边的不确定性，研究人员仍然无法确保gRNA的严格特异性，因此

专家们通常建议检测至少3-5个不同的gRNA。这些序列可以通过

例如SigmaAldrich公司，或者IntegratedDNATechnologies公

司合成，每个费用大约为10-20美元。

虽然Cas9和gRNA能通过各自的质粒来表达，但是研究人员

也可以选择在同一个质粒中表达gRNA和Cas9，这对于难转染的

细胞来说比较合适，比如免疫细胞。Addgene公司也提供这种双表

达质粒（价格为65美元）。不过为了快速地测试不同的gRNAs，

研究人员可以利用PCR构建编码gRNA的DNA片段，其中包含

激活表达的启动子，然后将这个片段与携带Cas9的质粒一同转染

细胞。这种方法无需克隆gRNA表达质粒，可以节约两天时间，来

自Broad研究院的张锋表示。

一旦你已经在细胞中表达了gRNA和Cas9酶，那么这一复合

物就能完成余下的工作，轻而易举地切断靶标DNA的两条链。尽管

细胞的DNA修复机制会试图修补片段，但是由于存在一个称为非同

源末端连接（nonhomologoundjoining）的过程，因此往往最终

会删除或添加一个或两个核苷酸，造成移码突变，阻止基因表达。这

样通过靶向基因起始位点的周围区域，研究人员就能阻断几乎所有的

表达。

如何检测基因编辑的效率？

虽然Cas9-gRNA复合物作用强大，但是我们可能仍然希望能

直接检测下这一工具是否正确突变了靶标，或者有没有出现脱靶的现

象。这种方法与ZFN、TALEN不同——后两者通常需要检测许多

融合蛋白，从中找到编辑靶标位点的那一个，CRISPR方法则往往

是利用尝试的第一个gRNA突变靶标，正如来自麻省总医院的病理

学家KeithJoung说的那样，他的实验室检测的约90%的gRNAs

都完成了目的靶标的突变。

然而，Cas9-gRNA在避免脱靶方面并不是那么可靠，去年发表

的少数研究表明，一些gRNAs出现了多达5次错配的脱靶问题。

不过还有一些研究表明gRNAs的特异性也很强，未曾出现过一次

脱靶。Joung表示，虽然没有又快又好的方法来提高特异性，但我

们可以挑选与潜在可能脱靶区域相似性最小的gRNAs，来进行这项

研究，CRISPRDesign等程序可以实现这一点。

Cas9-gRNA工具常用于失活许多细胞中的一个兴趣基因。研究

人员可以通过证明这个基因产物无法表达，或者由于基因产物缺失而

出现的某种细胞表型，来验证这个工具的作用。为了确保这些作用不

是由于突变了脱靶位点造成的，我们可以利用一种Surveyorassay

来直接分析DNA靶标位点，预测脱靶位点。这需要通过PCR，以

及一种特殊的酶（只切割带有突变的PCR产物）放大靶标位点，然

后再将突变和未突变的DNA片段在琼脂糖凝胶中分离开来，突变的

片段会小一些，因为它们被切断过。

这种方法也可以用于构建具有所有兴趣基因相同突变的克隆细

胞系，或者来自敲除小鼠的小鼠细胞，为了完成这些任务，我们可能

需要确保Cas9-gRNA复合物没有在未预测位点上引入一个突变。

对于这些实验我们可能还需要进行整个基因组的高通量测序。

如何优化gRNA的特异性？

除了挑选与非靶标位点互补性最小的gRNA序列以外，还有两

种可以减少脱靶效应的方法。

一个是转染的Cas9和gRNA表达质粒（或者gRNAPCR

盒）数量尽可能的少，只要满足所必需的靶活性的最低量就行。因为

这些浓度足以令靶标位点突变，就不会去突变非特异性位点，——脱

靶活性通常比靶向活性要低。

另一种策略是采用Cas9的另外一种突变版本：Cas9

nicka，这种酶只会切割结合gRNA的那条DNA单链。正常的

Cas9切割的是双链，单链缺口通常细胞会修补，但是如果细胞中表

达的是Cas9nicka，以及与同一DNA靶标结合的一对gRNAs，

那么缺口上就能会出现突变。这种方法可以降低脱靶活性，因为不太

可能两个gRNAs同时恰巧靠近脱靶位点。不过这种方法打靶效率

可能会比正常Cas9和单个gRNA低。

要想消除所有的脱靶效应是不可能的，因为其中许多可能出现在

基因组中的任何非编码区域。不过我们可以认为靶基因失活能引起可

见的细胞效应，如果几个结合不同基因区域的gRNAs出现了相同

的表型，那么就能假定具有不同的脱靶效应，Joung说。通过表达

质粒将基因引入细胞，恢复失活基因的表型也是一种不错的验证方

法。

利用Cas9-gRNA系统还能做什么？

过去一年半的研究表明，Cas9-gRNA系统可以用于多个方面，

比如张锋实验室就利用这一系统，在细胞中同时表达了，来自不同表

达质粒的5个靶向不同基因的gRNAs，以及来自一个独立表达质粒

的Cas9，切割所有靶标位点。“靶向超过5个基因也是可能的”，张

锋说。而要想利用ZFN和TALENS系统做到这一点，是不可想象

的，因为靶向单独一个位点都要花费大量的人力物力。

除了失活基因，利用Cas9-gRNA还可以纠正基因。来自佐治

亚理工学院的生物医学工程叫声包钢（GangBao，音译）正在朝着

这方面努力，他尝试纠正一个破坏性的单核苷酸突变，患有镰刀状细

胞贫血症的患者其β-珠蛋白基因上的两个拷贝就出现了这种突变。

研究人员利用Cas9nicka和一对gRNA造成双缺口，同时将一

个线性DNA片段转染进细胞中，片段大小通常为400-800碱基，

也可以是能作为基因纠正模板的小质粒。

另外一个方面就是利用Cas9突变，这个突变并没有完全切割

DNA，而是与能开启或关闭基因表达的蛋白结构域融合。gRNA可

以指导这个修改后的Cas9到达正确的遗传元件，比如启动子和增

强子，激活或抑制表达。这种用于基因抑制的方法被称为CRISPRi，

CRISPRi已被证明比RNAi（RNA干扰）更为有效。

注：本文标注的费用均为美国当地价格，仅供参考。

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ACRISPRFore-Cas-t

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