TEMED

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聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完

成。催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法（常用）和光聚合法。

PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。

连续系统电泳：体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同；

带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。

不连续系统：由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性；

带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条

带清晰度及分辨率比连续系统电泳的较好。

不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。

浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。

分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HC1。

电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。

2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓

冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。

SDS-PAGE各试剂作用

1.过硫酸铵（APS）为催化剂

2.四甲基乙二胺（TEMED）为加速剂：

在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时

甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构

是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分

子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。

4.强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。

在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和

SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不

同分子间的电荷差异和结构差异。

5.聚丙烯酰胺——为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促

凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液选择tris－HCL系统；

AP——提供自由基；

TEMED——催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；

十二烷基硫酸钠（SDS）——阳离子去污剂，作用：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、

取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

⒈配胶缓冲液系统对电泳的影响？

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCl缓冲系统，浓缩胶是

pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环

境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，

两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成

反比，这一区带便形成了较高的电压梯度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区

带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，

直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有

的带电性和分子大小进行分离。

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所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很

好解决问题的情况，应首要考虑该因素，当然其他的因素也可以从多方面考虑。

⒉样品如何处理？

根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带

有烷基化作用的还原SDS处理。

1）还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或β-巯基乙醇）后，蛋白质构

象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。

一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，

再离心加样。

2）带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的

保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。

100ul样品缓冲液中10ul20%的碘乙酸胺，并在室温保温30min。

3）非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，

未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

⒊SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？

聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳

成功与否，与促凝剂及环境密切相关；

制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris－HCl系统，TEMED与

AP：AP催化剂，催化单丙和双丙聚合成聚丙烯酰胺。TEMED四甲基乙二胺，催凝剂，加

速AP催化作用；十二烷基磺酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解

离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。

⒋提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？

聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在

室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导

致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，

具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。

⒌“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？

主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。

处理办法：待其充分凝固再作后续实验。

⒍“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？

主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。

处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

⒎为什么带出现拖尾现象？

主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。

处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间

过长，重新配制；降低凝胶浓度。

⒏为什么带出现纹理现象？

主要是样品不溶性颗粒引起的。

处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。

⒐什么是“鬼带”，如何处理？

“鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶

中）的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而

失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其

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分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在

WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。

处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；

或可加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

⒑为什么溴酚蓝不能起到指示作用？

我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象。主要与缓冲

液和分离胶的浓度有关。

处理办法：更换正确pH值的Buffer；降低分离胶的浓度。

⒒为什么电泳的条带很粗？

电泳中条带很粗是常见的事，主要是未浓缩好的原因。

处理办法：适当增加浓缩胶的长度；保证浓缩胶贮液的pH正确(6.7）；适当降低电压；

⒓为什么电泳电压很高而电流却很低呢？

这种现象一般初学者易出现。比如电压50v以上，可电流却在5mA以下。主要是由于

电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底

部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：电泳槽正确装配即可。

⒔浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗？

这主要出现在初学者中，一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不

均匀或过猛所致；后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧而致空气进入引起的。

⒕凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事？

通常胶在30MIN-1H内凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，APS剂量不够或者失效。

APS应该现配现用，TEMED不稳定，易被氧化成黄色。如果凝的太快，可能是APS和TEMED

用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

⒖电泳时间比正常要长？

可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物

质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

⒗分离胶加上后为什么要立即加水？

加入分离胶后，立即覆一层双蒸水，一是为了使分离胶界面保持水平，用水就可以把它

压平，使蛋白质分子跑时在同一水平线上；二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。

⒘连续分离胶体系配制（凝胶板厚度0.75mm，长度10cm）100ml体系：双蒸水37.5ml

尿素20--50g

10×TBE缓冲液8ml

30%丙烯酰胺10ml

APS（过硫酸铵）500--800ul[注：现配现用]

TEMED（四甲基乙二胺）23.5ul

18.电泳条带呈波浪状(电泳条带,波浪状,缓冲液,琼脂糖)

可能性1：胶没有凝好；2：电解液可能用的时间太长；3电解槽中是否放了其他东西，

例如梳子，从而影响电场;4：电泳缓冲液太少了,没有没过胶面;天气慢慢热了,缓冲液蒸发很

快的,电泳时应该检查一下电泳液是不是够;我前一段时间电泳就出现了这样的问题,结果跑

出的带是凸凹不平的.