rnaa

实验三Trizol法提取细菌总RNA

一、实验原理

Trizol主要物质是异硫氰酸胍,它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时,保护

RNA的完整性。加入氯仿后离心,样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层

RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动

Trizol法对少量的组织(50-100mg)和细胞(5×106)以及

大量的组织(≧1g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单

性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总

RNA能够避免DNA和蛋白的污染。

二、主要试剂和器材

Trizol溶液氯仿异丙醇75%乙醇0.1%DEPC水超净工作台2.0mL

Rna移液枪紫外分光光度计石英比色皿泳槽和模具电

泳仪凝胶成像系统大肠杆菌

三、实验步骤

.采用Trizol溶液提取细菌的总RNA

1.2.0mL于2.0mL离心管离

2、每管加入1mLTrizol溶15s

静置5min412000g10min(约1mL)新的2.0mL离

3、每管加入0.2mL的氯仿(0.2体积Trizol)15s

静置3min4℃,12000g,离心10min，小心吸取上层水相转入另一新的2.0mL

离心管，测量其体积,

4、加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡15s，室温静置3min，4℃12000g

离心10min，转入另一已编号新的2.0mL离心管。

5、加入0.5mL的异丙醇(0.5体积Trizol)，室温静置10min，

4℃12000g10min，RNA沉于管底，

6、加1mL75%的乙醇(预冷),并轻柔颠倒，47500g5

min,小心弃上清，微离吸去剩余乙醇，室温干躁10min。

7、各管用30μLDEPC处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5min，分装，

-80℃贮存(可贮存5周)。

.RNA浓度的测定

取10µLRNA样品以双蒸水稀释至2mL

干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照。在紫外分

光光度计中分别测定260nm、280nm的光吸收值。根据公式计算RNA的浓度。

RNA浓度(µg/µL)=OD260×稀释倍数(200)×40(µg/mL)/1000

纯RNA样品的OD260/OD280比值为1.8~2.0，表明存在蛋白质

，可重新用酚∕氯仿抽提。该值为2.0RNA纯度为最高。

.RNA质量检测

将RNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测23S和16S条带的完整性

23S和16S23S

的亮度在16SRNA的质量较好。

(1)

(2)准确称取0.15g琼脂糖加入15mL1×TAE中,摇匀,在微波炉内将琼脂糖

溶液以最短时间完全溶解(中火档2min),待冷却至60℃时,加入EB(终浓度为

µL/mL),充分混匀。(3)插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚

度为3~5mm，置于室温下凝固。

(4)待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液使液

面高出凝胶1~2mm。

(5)用微量移液器将样品8µL与上样缓冲液2µL混合并将混合液小心加入上样孔

内，同时加入合适分子量范围的DNA2000bp。

(6)100V15min左右。

(7)电泳完毕后将凝胶置于紫外透射

保存。

四、注意事项

制备的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的

RNA分解酶的污染。EP管及Tip头都要用0.1%处理(0.1%DEPC浸泡过夜后高

压蒸气灭菌)。用于RNADEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛

0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。最好在超净

台内操作。

2

操作过程中避免讲话等。这样做的唯一目的就是两个：一是小心RNA的污染

降解RNARNA的完整性。

3、电泳液需新鲜配制。电泳槽和模具需预先进行处理。

4.一般RNA

(这样也是为了减少外界RNA

对RNA的降解)

5、需要用EB染色，Genefinder染色效果不好，其对双链DNA的效果好。

6，若用玻璃器皿，应在使用前按下列

方法进行处理。

（1）用0.1%DEPC焦碳酸二乙酯水溶液在37℃下处理12小时。

（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器

具建议专门使用，不要用于其它实验。

实验二细菌DNA提取方案

一、实验原理

要进行重组DNA实验，就离不开外源基因的纯化，而外源基因主要来源之一就

要直接从生物的染色体DNA上制备，所以制备高质量的染色体DNA样品经常

为基因工程实验所需要。

作为基因工程的载体必须满足下面四个条件：

1.是一个复制子，有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；

2.他必须要有很高的复制率，这样才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；

3.有限制性内切酶的识别位点，便于外源基因的插入；

4.载体具有选择的遗传标识，以此判断载体是否进入受体细胞，并将其分离出来。

因此基因工程实验所需要的基因组DNA通常要求分子量尽可能大，以此增加

外源基因获得率，但要获得大片段的DNA非易事。

对于细菌来说，细菌细胞具有坚硬的细胞壁，提取难度将大于真核细胞。细

菌基因组DNA在抽提过程中，不可避免的机械剪切力必将切断DNA，如果要抽

提到大的DNA分子，就要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分

子的可能性；分子热运动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要

尽可能在低温下进行。另外细胞内及抽提器皿中污染的核酸酶也会降解制备过程

中的DNA，所以制备过程要抑制其核酸酶的活性。（温和操作）。另外制备的

DNA必须是高纯度的，以满足基因工程中各种酶反应的需要，制备的样品必须

没有蛋白污染，没有RNA，各种离子浓度应符合要求，这些在染色体制备时都

应考虑到。

DNA不溶于95%的酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利

用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。并且用酒精可以洗脱在前

几步实验中使DNA携带的盐离子。

对于细菌而言，有染色体DNA和质粒DNA，因此要将其分离开。处理过程

中，细菌染色体DNA缠绕在细胞膜碎片上，离心时容易被沉淀下来，而质粒

DNA则留在上清液中，上清液中还可能有蛋白质，核糖核蛋白和少量的染色体

DNA。大肠杆菌染色体DNA抽提首先收集对数生长期的细胞，然后用离子型

表面活性剂十二烷基磺酸钠（SDS）破裂细胞，SDS具有的主要功能是：

（1）溶解细胞膜上的脂类和蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；

（2）解聚细胞膜上的脂类和蛋白质，有助于消除染色体DNA上的蛋白质；

（3）SDS能与蛋白质结合成为R1—0—SO3R2—蛋白质的复合物，使蛋白质变

性而沉淀下来。

SDS也能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它除干净。

以免影响下一步RNa的作用。

破细胞后RNA经RNa消化除去，蛋白质经苯酚、氯仿—异戊醇抽提除去。

含有质粒DNA的上清液用乙醇或异丙醇沉淀，回收DNA。此种方法抽提的细

菌染色体DNA，无RNA和蛋白质污染，可用于限制性内切酶消化，分子再克隆

等。

但在下一步实验前，要测定其DNA的浓度，常用测定DNA浓度的方法，是溴

化乙锭电泳法；当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的EB会增强发射的

荧光。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，

就可估计出待样品的浓度。

本实验利用的就是使用裂解液（含去污剂SDS）将细胞壁破坏，裂解后，用

乙醇将DNA沉淀下来。

二、实验材料

①LB液体培养液

②酚/氯仿（1：1）：一般市售的酚需要重蒸处理，市售的酚常含有杂质而呈粉色

和淡黄色，需要重蒸二次，收集沸点160℃部分，小瓶分装，瓶内空腔充氮气，

－20℃密封保存，以免氧化，用前从冰箱中取出，68℃蒸馏水饱和，加入8—羟

基喹啉（100g酚加0.1g），酚变为黄色。8—羟基喹啉是抗氧化剂，并能部分抑

制核糖核酸酶，含8—羟基喹啉的酚用等体积1.0mol/LpH8.0Tris缓冲液抽提，

再用0.1mol/LpH8.0含0.2％β－巯基乙醇的Tris缓冲液抽提数次，酚溶液的pH

应大于7.6。此酚溶液在平衡缓冲液覆盖下4℃可保存一个月，纯化和制备酚溶

液都要带手套，以免损伤皮肤。

③核糖核酸酶：无DNA酶污染，将胰RNA酶（RNA酶A）溶于10mmol/LTris

－Cl(pH7.5)15mmol/LNacl溶液中，浓度为10mg/ml.于100℃加热15分钟，缓

慢冷却至室温，分装后于－20℃保存。

④TEG缓冲液：pH8.025mmol/LTris-HCl,10mmol/LEDTA,50mmol/L葡萄

糖,4mg/mL溶菌酶

⑤标准菌株：大肠埃希氏菌

⑥碱裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS

⑦乙酸钾溶液、乙酸钠溶液、溶菌酶溶液、丙酮溶液。

三、方法与步骤

1)将大肠杆菌接种于LB培养基在37°C环境下，以150r/min震荡过夜培养。

2)取1ml对数期菌液，12000rpm5min；

3)弃上清，将沉淀溶于200ul丙酮，震荡混匀，冰浴5min。

4)8000rpm离心2min，弃上清。

5)将沉淀混于TEG缓冲液中，震荡混匀，冰浴5min

6)加入200ulSDS裂解液，冰浴5min

7)加入150ul乙酸钾溶液，冰浴15min，使其沉淀完全。

8)4°C下离心，12000rpm，5min。（乙酸钾能沉淀SDS与蛋白质的复合物，并

使过量的SDS-Na+转化为溶解度很低的SDS-K+一起沉淀下来。）离心后，若上

清液浑浊，应混匀后再冷至0°C，重复离心，弃去上清。

9)加入等体积的酚-氯仿饱和溶液，反复震荡，离心，12000rpm2min（比单独

用酚，氯仿除去蛋质效果更好。为充分除去残余的蛋白质，可以进行多次抽提，

直至两相间无絮状蛋白沉淀）。

10)将上清移至新管，加入2倍体积预冷无水乙醇，混合摇匀。

11)-20C，15min后，4°C下离心12000rpm5min。

12)1ml70%冷乙醇洗涤沉淀，然后离心，弃去上清液。

13)干燥，100ul20ug/mlRNaA，37C，30min。

14)2倍体积无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗涤(沉淀DNA可以使用一倍体积异丙

醇或2倍体积乙醇。)

15)干燥，溶于50ulTE（倒数一二步是我们制备的DNA马上就要用的情况，

若需保存，则是在使用之前加入RNa。）革兰氏阳性菌，由于细胞壁的结构

与阴性菌有差别，裂解比阴性菌稍微麻烦一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修

改，在第四步加入终浓度2mg/ml的溶菌酶，37度温育1h。

四、实验注意

1.提基因组最好要将枪头尖剪掉（剪掉以后在酒精灯上迅速过一下，使其断口圆

滑）。以免枪头损伤DNA。

2.最好是风干。

3.最好能够使用新鲜的菌体。过程中注意无菌操作。

4.菌量有一定的要求，通常为菌液的OD600=1.9时，取1-2ml就可以了。

5.第一步悬浮时，振荡的时间稍长一些（1-2分钟），充分悬浮菌体。

6.裂解步骤中，如果不澄清说明菌体没有裂解，可能的原因有：a菌量太大；

b该菌为厚壁的非革兰氏阴性菌。

7.沉淀DNA可以使用一倍体积异丙醇或2倍体积乙醇。

8.加洗液RnaA，量要加足，以防止清洗不净影响未来的实验。

9.要尽可能地温和操作，减少剪切力，减少切断DNA分子的可能性；分子热运

动也会减少所抽提到的DNA分子量，所以提取过程也要尽可能在低温下进行。

10.加入乙酸钾后，可用小玻璃棒轻轻搅开团状沉淀物，防止DNA被包埋在沉淀

物内，不易释放出来。

11.注意在吸取上层水相时勿吸入下层有机相