倍比稀释

病毒TCID50测定(组织半数感染量）

操作步骤

(1)准备细胞

取出一块细胞培养板，每个孔大约传8000～10000个细胞（一个T25瓶的细

胞消化后加10ml培养液正好传一块96孔板，要传匀)。每个孔的细胞铺成单层大约60％丰

度即可接种病毒（下午传好板第二天早上就能用)。

细胞对照选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要窜孔。

也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致.

(2）稀释待测病毒液。

A法为参考书上标准的操作方法

B法参照书将液体量减少后的结果

病毒稀释液根据是否需要胰酶来选择适合的液体，无论哪种都无血清。

A向每支试管中加入1。8ml病毒稀释液。向1号试管中加入0.2ml病毒,依次10倍系列稀

释至适宜浓度，最后一支试管。

B在EP管中用无血清的孵育液10倍倍比稀释病毒原液(10—1，10—2…10—10等），根据

病毒大致的滴度确定稀释的倍数。首次滴定可以多稀释几个滴度.

根据接种的孔数稀释病毒,常规每个稀释度接种4孔,则每个稀释度配500＆micro;l，即10—1

为50µ；l加入450＆micro；l的孵育液中;如每个稀释度接种8个孔,则各配制1ml，即

10-1为100µ；l加入900µl孵育液中.若接种8个孔，则相应增加液体量。上述

的配液并不是固定不变的,可以根据接种的量自行调整。

【！此步操作注意事项：

1）建议每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。

2）病毒稀释过程中一定将病毒液与孵育液充分混匀.

2)此过程中需要使用加样器和tip头。使用前用75%乙醇擦拭加样器,并用紫外线照射20min，

确保无菌。使用新高压的tip头，外包装一定在超净台（或安全柜中打开）.】

(3）接种

取细胞培养板,用多道加样器（又称排枪）吸去96孔板中的培养液，吸取孵育液加在每孔中

再轻轻吹打一次，然后吸出孵育液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。

将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100µl，根据观察的习惯，一般从右到左,从

上到下,从高稀释度到低稀释度（10—1，10-2）到原液加样。【切记：设置正常的细胞对照.

每次实验要重复4次,计算标准差.】

37℃CO2培养箱中孵育1h，取出培养板吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取可避免窜孔），

加入维持液200µl继续在37℃CO2培养箱中培养.

(4)培养

将培养板放置于CO2培养箱。培养温度,培养天。

（5)测定结果

取出培养板，显微镜下观察细胞病变。

计算方法

1）Spearman—Karber法

LgCCID50/0。2ml=—（X0—d/2+d×∑R1/N1）

X0=全部病变最低稀释度对数

d=稀释因数对数

N1=每个稀释度所种的孔数

R1=病变孔数

∑=积和

LgCCID50/ml=LgCCID50/0。2ml+0.7

2)Reed-Muench法

观察CPE，找出能引起半数细胞瓶或管感染的病毒稀释倍数，按计算出该病毒液的TCID50

由表看出，能使50％细胞管出现病变的病毒稀释度在10-4~10—5之间，其中间距离比例按

Reed和Muench公式计算:

TCID50＝高于50%病变的病毒最高稀释度的对数＋距离比例

故能使50%细胞管发生病变的病毒稀释度为10-4。5，即TCID50为104。5倍,当病毒悬液

做104。5倍稀释时，0。1ml中含1个TCID50,作其他一些实验时（如中和试验），一般常

用100TCID50/0。1ml。

3）判定标准

细胞对照无病变，在无标准品时，应增加实验次数以减少误差。

1。病毒滴度的测定（组织细胞半数感染量—TCID

50

滴定)

1)流感病毒的制备

利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝试验测定病毒的存

在，分装后-70℃冻存。

2）病毒的稀释

取1管冻存病毒尿囊液，1：100稀释。

第一排孔加入146μl1：100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使

之成为10－2、10－2.5、10－3、10－3。5……10－7。每孔含有100μl病毒液，每个稀释

度重复4孔。

人流感病毒一般在胰酶存在的条件下才能感染MDCK细胞，因此病毒稀释液中

需加入2μg/mlTPCK-胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在无胰酶存在条件下即可

感染MDCK细胞，因此在测定新病毒滴度时，最好配制含有和不含有胰酶的两种稀

释液，以获得最佳结果.

3）MDCK细胞的准备

使用前2天将MDCK细胞1:10传代，使之70～90%成片,处于对数生长期的细胞

对病毒具有最大的敏感性，细胞过度生长以及代数太高（大于30代)将使细胞对

病毒的敏感性降低。

弃去细胞培养液，用5毫升EDTA—胰酶洗细胞一次，然后弃去。

加4至5毫升EDTA—胰酶覆盖细胞(162cm2的细胞培养瓶）37℃,5%CO

2

温箱中消

化10～20分钟.

待细胞开始脱落时,加入5～10毫升MDCK细胞培养液，吹打分散细胞，并将细

胞转入离心管,2000转离心5分钟，用PBS洗涤2次,以除去牛血清。

将细胞悬浮于1毫升病毒稀释液中，用吸管充分吹打分散细胞，再加病毒稀

释液至10毫升。在细胞计数板上计数细胞是数量。

用病毒稀释液将细胞稀释成1.5×105细胞/毫升

加100μl细胞(1.5x104细胞/孔)于已稀释好病毒的微量细胞培养板中。

在37℃，5%CO

2

孵箱中培养18~20小时。

病毒TCID

50

滴度的计算：

组织培养半数感染量是病毒感染一半组织细胞时的病毒的稀释度,一般使用

Reed-Muench方法计算，详细过程见表

稀释度阳性数目

(1）

阴性数目

（2)

阳性数

（3）

阴性数

（4）

比率

（5）

阳性数百

分比（6)

10～44011011/11100

10～4。540707/7100

10～531313/475

10～5.504050/50

1．计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）

2．计算阳性和阴性孔的累积数

阳性孔累计数由下向上累积(3）；阴性孔累积由上向下累积(4）

3．计算阳性孔的百分比:比率（5）=（3）/［（3）+（4）］；

(6）=（5）×100

4．计算距离比

距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性比—小于50%的阳

性百分比）=(75—50)/（75—0）=0。3

TCID

50

的对数=大于50％的阳性百分比的最高稀释对数+距离比例x稀释系数

的对数

=5+0.3×0.5=5。15

TCID

50

=10-5。15/100微升

100TCID

50

/100微升=10-3.15

100TCID

50

/50微升=10—3。15/2=10-3.15+0.3=10—3.15=1：1631

5．稀释系数的对数

1：10稀释为1；半对数稀释为0。5;倍比稀释为0.3;1：5稀释为0.7