OD600

方案24制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法:

制备超级感受态细胞

采用Inoue的方法(1990)制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法(1980)

的转化效率。但在标准的实验室条件下，达到1×108~3×108个转化克隆/μg质粒DNA的转

化效率更为常见。与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重

复性更好，而且更有预见性。

这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37t。否则这个方

法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。没有人知道为何在低温进行细

菌培养会影响转化效率。也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许

是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。

在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇

床。将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18℃是一个解决问题的方法。也可使培养物的温度

维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低。这一温度在很多实验室其实是室温。在这

一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。如此缓慢的生长可能会导致培养失

败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD

600

吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。解决

这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。分子克隆中常用的很多大肠杆菌品

系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1,JM103、JM108/109、DH5α和HB101。

材料

注意:标记(!)试剂的正确操作，请参见附录12。

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。使用时将贮存液稀释至适当浓度。

二甲亚砜DMSO(!)

二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物(Hanahan1985)。为避免上述问

题，应购买高质量的DMSO。

Inoue转化缓冲液(见步骤1)。

用前置于冰上预冷至0℃。

核酸和寡核苷酸

质粒DNA(重组质粒)

构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。

培养基

LB或SOB培养基(培养最初的细菌生长物)

SOB琼脂板，含20mmol/LMgSO

4

和适当的抗生素。

标准的SOB琼脂板含10mmol/LMgSO

4

。

SOB培养基(培养转化的细菌)

培养前，准备3个内盛250ml18~20℃SOB的lL锥形瓶。

SOC培养液

每个转化反应约需lml。

离心机和转头

SorvallGSA转头或与之相当的转头

专用设备

液氮(!)

聚丙烯管(17×170mm;Falcon2059)，冰上预冷

18℃摇床

温度可调42℃的水浴装置

方法

重要:本方案的所有程序都必须进行无菌操作。

制备感受态细胞

1.准备Inoue转化缓冲液(用前冰上预冷)。

来自配制转化缓冲液的水的有机污染，会降低感受态细胞的转化率。因此，采用直接从质

量很好的Milli-Q过滤系统(Millipre)取得的水将会得到满意的结果。假如出现问题，使用前用

活性炭处理去离子水。

a.0.5mol/L的PIPES(pH6.7)[哌嗪-N，N`-双(2-乙磺酸)]溶液的配制：将15.1gPIPES溶

于80ml水中(Milli-Q级，或与之相当级别的)，用5mol/LKOH调pH值至6.7，最后加纯水，

定容至100ml。用预先处理的Nalgene滤膜(0.45μm孔径)过滤、除菌。分成小份于-20℃保存。

转化缓冲液的配制：将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml0.5mol/L的

PIPES(pH6.7)，加纯水定容至1L。

试剂需要量/L终浓度

MnCl

2

·4H

2

O10.88g55mmol/L

CaCl

2

·2H

2

O2.20g15mmol/L

KCl18.65g250mmol/L

PIPES(0.5mol/L,pH6.7)20ml10mmol/L

H20补至lL

c.用预先处理的Nalgene滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌。分成小份于-20℃保存。

2.挑取一个经37℃培养16~20h平皿上的单菌落(2~3mm直径)，接种至250ml锥形瓶中的

25mlLB培养液或SOB培养液中，37℃摇床(250~300r/min)培养6~8h。

3.晚上约6点钟，将上述初始培养物接种于三个盛有250mlSOB培养液的1L锥形瓶中，第

一个加10ml，第二个加4ml，第三个加2ml，于18~22℃中速摇床过夜。

4.次日早上，测量三瓶培养物的OD

600

值，每45min测定一次。

5.当有一瓶的培养物OD

600

=0.55时，将培养瓶置于冰上10min，弃去另两瓶培养物。

由于大多数实验室的昼夜温差较大，而且温差也随一年四季及工作人员数的变化而变化。

因此，很难预测合适OD值的时期，尤其是晚上。同时培养三瓶不同浓度梯度的菌液，可以

提高成功的机会，培养过夜的菌液至少有一瓶是符合要求的。

6.于4℃以2500g(相当于SorallGSA转头，3900r/min)离心10min收集菌体。

7.倒去培养物，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，用一个真空吸引器将贴附

在管壁上的培养基吸干。

8.加80ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。轻轻旋转，不要用振荡器或吹吸混匀。

9.于4℃2500g(相当于SorallGSA转头3900r/min)离心10min收集菌体。

10.倒去上层培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余被体，用一个真空吸

引器将附在管壁上的培养基吸干。

冻存感受态细胞

11.用20ml预冷的Inoue转化缓冲液轻轻重悬沉淀。

12.加1.5mlDMSO。轻轻混匀细菌悬液，放置冰上10min。

13.迅速将悬液分装到冷却的无菌微量离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。

贮存于-70℃备用。

用液氮速冻可以提高转化效率约5倍。

就大多数克隆方面的用途来说，50μL感受态细胞悬液已绰绰有余了。然而，如需要更大

量的转化菌落(如构建cDNA文库)，每小份感受态细胞的量可能需要加大些。

14.需要时，从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手心，融化细胞。细胞一经融化，

立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10min。

15.用一冷的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管(17×170mm)中，放置在冰浴

上。不用玻瑞管是因为它们会降低转化效率约10倍。

转化

包括阳性和阴性对照(请见方案23中的专栏"细菌转化")

16.将要转化的DNA片段加入到装有感受态细胞的管中(50μl感受态细胞需25ngDNA)，体

积不应超过感受态细胞的5%，轻轻旋转几次混匀内容物。实验中至少设对照管:一个含有感

受态细胞和已知量的超螺旋质粒DNA，另一管只有感受态细胞。海匀内容物，冰浴30min。

17.将管放入预加温至42℃的循环水陆中，恰恰放置90s，不要摇动。

热激是一个关键步骤，准确地达到热激温度非常重要。这里的温度及温育的时间都是使用

Fa1con2059管的测量参数，其他类型的管将可能获得不同的结果。

18.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。

19.每管加800μlSOC培养基，用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到设置为37℃的

摇床上，温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高

转化率，复苏期中应温和地摇动细胞(<225r/min)。如果带有α互补，请接方案27。

20.将适当体积(每个90mm平板达200μ1)已转化的感受态细胞转移到含20mmol/LMgSO

4

和

相应抗生素的SOB培养基上。

如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或软琼脂中)，

可以先在微量离心机上室温离心20s以收集转化菌，轻拍管壁的同时加入100μlSOC重悬沉

淀。

重要：玻璃铺菌器先需在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转

化菌轻轻地铺在琼脂板表面。

如检查氨韦青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低(每个90mm平极不超过104菌

落)，于37℃培养的时间不超过20h。氨莘青霉素抗性的转化体可将ß-内酰胺酶分泌到培养基

中.迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现

对氨苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生

素浓度从60μg/ml提高到100μg/ml，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨苄青霉素

菌落的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细

胞释放生长抑制物质的缘故。

21.将平板置于室温直至被体被吸收。

22.倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。

转化克隆可以用本章方案27、28、31、32或第8章方案12中所介绍的方法进行重组质粒

的筛选。

方案25用氯化钙制备和转化感受态大肠杆菌

下面的方法是对Cohen等于1972年发表的方法更为便捷的修改。这一方法可以用于批量

制备感受态细胞，其转化效率可达到5×106-2×107个转化克隆/μg超螺旋质粒DNA。这个转

化效率对于方便地进行质粒中克隆已经足够高了。用此方法制备的感受二细胞可以在-70℃冻

存。但随着冻存期的延长，转化效率会有所降低。

材料

缓冲液和溶液

贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。使用时将贮存液稀释至适当浓度。

CaCl

2

·H

2

O(1mol/L)

制备感受态细胞时取出10mL贮存液加90ml纯水稀释至100mL，用预先处理的Nalgene

滤膜(0.45μm孔径)过滤除菌，放置冰上。

或

标准的转化缓冲液(TFB)(见方案23步骤1)。对许多大肠杆菌的菌株，用标准TFB代替

CaCl

2

可获得一致或更好的结果。

MgCl

2

-CaCl

2

溶液，冰上预冷

培养基

LB或SOB培养液(培养最初的细菌生长物)

SOB琼脂板，含20mmol/LMgSO

4

和适当的抗生素。

标准的SOB琼脂板含10mmol/LMgSO

4

。

SOC培养液

每个转化反应约需1ml。

核酸和寡核苷酸

质粒DNA(重组质粒)

构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。

离心机和转头

SorvallGSA转头或与之相当的转头

专用设备

聚丙烯管(50mm)，冰上预冷

聚丙烯管(17×100mm;Fa1con2059)，冰上预冷

可调至42℃的水浴装置

方法

重要:本方案的所有操作都必须在无菌条件下进行。

制备感受态细胞

1.从37℃培养16~20h的平板中挑取一个单菌落(直径2~3mm)，转到一个含有100mlLB

或SOB培养基的1L烧瓶中。于37℃剧烈振摇培养3h。一般经验，1OD

600

约含有大肠杆菌

DHI109个/ml。

为达到高效转化，活细胞数务必少于108个细胞/时，对于大多数大肠杆菌来说，这相当于

OD

600

值为0.4左右。为保证细菌培养物的生长密度不致过高，可每隔15-20min测定OD

600

酬值来监测，用监测的时间及OD

600

值列一个图表，以便预测培养物的OD

600

值达到0.4的时

间，当OD

600

值达到0.35时，收获细菌培养物。

在菌株与菌株之间，OD

600

值与每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测

量特定大肠杆菌的生长培养物在生长周期的不同时相的OD

600

值，并将各稀释浓度的培养物铺

于无抗生素的LB琼脂板以计算每一时相的活细胞数，从而使分光光度计读数得到标准化。

2.将细菌转移到→个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置

10min，使培养物冷却至0℃。

3.于4℃用SorvallGS3转头(或与之相当的转头)以4100r/min离心10min，以回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

5.每50ml初始培养液用30ml预冷的0.1mol/LCaCl

2

-MgCl

2

溶液(80mmol/LMgCl

2

,

20mmol/LCaCl

2

)重悬每份细胞沉淀。

6.于4℃用SorvallGS3转头(或与之相当的转头)以4100r/min离心10min，以回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min以使最后的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl

2

(或TFB)重悬每份细胞沉淀。

9.此时，可以按步骤10~16用新鲜制备的感受态细胞直接做转化实验，也可以将细胞冻

存于-70℃(见方案23步骤12)。

对大多数大肠杆菌(MC106除外)，在这一步采用TFB代替CaCl

2

可得到相同或更好的结

果。

Dagert和Ehrlich的实验(1979)曾表明，细胞可以于4℃在CaCl

2

溶液中保存24-48h，在

贮存的最初12-24h内，转化率增加4-6倍，然后降低到初始水平。

转化

包括阳性和阴性对照(见方案23中的专栏"细菌转化")。

10.用冷却的无菌吸头从每份用CaCl

2

溶液制备的感受态细胞悬液中吸取200μl转移到无

菌离心管(17×100mm)中，每管加入DNA(用不超过10μL的体积，其中的DNA小于50ng)，

轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30min。

11.将管放入预加温至42℃的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动管。热激是一个关键步

骤，准确地达到热激温度非常重要。

12.快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。

13.每管加800μLSOC培养基，用水洛将培养基加温至37℃，然后将管转移到摇床上，

温育45min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。复苏期中应于37℃温和地

摇动细胞(用低于50r/min转速的摇床)。

如果用α互补筛选，请接方案27铺板。

14.将适当体积(每个90mm平板达200μ1)已转化的感受态细胞转移到含20

mmo1/LMgSO

4

和相应抗生素的SOB琼脂培养基上。

如果用四环素作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上(或软琼脂中).

可以先在微量离心机上室温离心20s以收集转化菌，加100ΜlSOC重悬沉淀，轻轻混匀。

重要:玻璃铺菌器需先在乙醇中浸泡，然后在酒精灯上灼烧，待它凉至室温后，才可将转化

菌轻轻地铺在琼脂板表面。

如检查氨苄青霉素的抗性，用转化菌铺平板时密度应较低(每个90mm平板不超过104茵落).

于37℃培养的时间不超过20h。氨苄青霉素抗性的转化体可将ß-内酰胺酶分泌到培养基中，

迅速灭活菌落周围区域的青霉素。这样，铺平板时密度过高或培养时间过长都会导致出现对氨

苄青霉素敏感的卫星菌落。在选择培养基中不用氨苄青霉素而用羧苄青霉素，以及将抗生素浓

度从60μg/mL提高到100μg/mL，可使情况有所改善，但不能彻底根除之。抗氨苄青霉素菌落

的增加与平皿上所加的细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞释

放生长抑制物质的缘故。

15.将平板置于室温直至液体被吸收。

16.倒置平皿，于37℃培养，12-16h后可出现菌落。

转化克隆可以用本章方案27、28、31、32或第8章方案12中所介绍的方法进行重组

质粒的筛选。