血凝实验操作报告

血凝实验操作报告

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血凝实验操作报告

　　在人们越来越注重自身素养的今天，需要使用报告的情况越来越多，报告具有成文事后性的特点。其实写报告并没有想象中那么难，下面是小编整理的血凝实验操作报告，仅供参考，欢迎大家阅读。

　　血凝实验操作报告 篇1

　　禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项

　　禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。

　　一、 血凝试验操作程序

　　1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。

　　2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。

　　3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。第三排孔至第四排孔同上操作。

　　4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。

　　5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。

　　6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）

　　二、血凝抑制试验操作程序

　　1、怀念过去 歌词根据血凝试验结果配制4HAU抗原。（即1HAU抗原除以4）

　　2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。

　　3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。

　　4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。

　　5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。

　　6、每孔加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。置于微量振荡器上轻轻混匀，室温（20-25℃）静置40 min后观察结果，若环境温度过高，可于4℃条件下进行，红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。

　　7、结果判定：只有阴性对照孔血清滴度不大于2 log2，阳性对照孔误差不超过1个滴度，试验结果才有效。 将酶标板作45°倾斜，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数判为该血清的血凝抑制滴度。当被检血清效价大于等于4log2，判为禽流感抗体阳性。

　　三、试验过程中的注意事项

　　1样品的保存及试验前处理

　　1.1 采集的血液样品应及时分离血清，最好分装至离心管中，标记清楚，离心后吸出血清，对应编号冷藏送检，并禁止运输过程中剧烈震动。

　　1.2 一般情况下，在5天内检测的样品可放置在4℃的冰箱中冷藏，否则低温冷冻保存。

　　1.3 在检测前血清样品应充分混匀，混匀时采用上下缓慢颠倒几次的方法即可，切忌剧烈振荡而引起产生气泡及血清中蛋白变性。

　　1.4 对出现胶冻状的血清样品，可采用反复搅动几下再离心的方法有助于缓解该状态。胶状物是含纤维蛋白和纤维蛋白原的血清，可能是由于放置时间不够造成的血清未完全析出状态。不建议直接吸取其中少量的清亮血清。

　　1.5 水禽等样品为排除非特异性反应，还应相应进行灭能反应。具体操作方法：56℃水浴锅30min或加等量10%鸡红细胞，轻摇后静置30分钟，离心，收集上清液即可。

　　2器材的选择

　　2.1 酶标板的选择：

　　建议使用96孔90°V型板进行试验，通过反复试验证明：90°V型板相对于110°板及130°板来讲，具有红细胞沉降速度快，产生的凝集图像清晰、结果容易判定等优点。

　　2.2 移液枪的选择及使用：

　　①单道、多道可调微量移液枪应选择合适的量程，以便精确度的提高。

　　②使用时应采用一档吸液二档排液的方法。吸取液体时，枪头要深入液下缓慢平稳吸液。加缓冲液时

　　应加在板孔底部。倍比稀释血清时，应每孔至少反复吹吸6次，以便混合均匀，还应注意尽量避免产生泡沫引起混合不均。加抗原及红细胞时应在板内液面上方加样，以免交叉污染，影响试验结果。

　　③加样、倍比稀释时应高度集中注意力，以免漏加、重复加样等。

　　3试剂的保存及配置

　　3.1 禽流感血凝抑制试验所用的抗原、阳性血清应严格按照说明书的要求进行保存和配置，试验前应提前将其恢复至室内温。抗原的保存温度为-20℃，反复冻融会降低抗原的滴度，应避免反复冻融。

　　3.2 PH7.2、0.01mol/L的PBS液的制备

　　①应尽量现用现配

　　②每次使用前应测PH值，以免时间过长而导致PH值发生改变。

　　③由于PH试纸跨度范围偏大，PH值不易准确介定，因此最好采用酸度计准确测量PH值，以提高试验的精确度。

　　④全部试验均采用同一种稀释液。

　　3.3 1%红细胞的制备

　　①为避免有些鸡只的红细胞有自凝现象，因此配制1%红细胞悬液时应最好选择采取2-3只SPF鸡或未进行过任何免疫过的成年公鸡血液。当然采血的前提条件是要按十分之一采血量比例在一次性注射器中加入抗凝剂，如肝素、枸椽酸钠、柠檬酸钠等。

　　②采血完毕后最好分装至2ml容量的圆底离心管中，因为通过2ml与1.5ml两种容量离心管相比较，放入1.5ml尖底离心管中的话，离心后，离心管底部红细胞不易与加入的PBS液混匀，易沉积在管底部，达不到洗脱干净的目的。

　　③经2000~3000r/min，5~10min，弃去上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒（切忌用力过大使红细胞破裂），使其充分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。

　　④在加红细胞过程中还须不断轻摇以确保红细胞均匀，使其每孔加入相同数量的红细胞。

　　⑤制备好的红细胞液如果放置后上清液变红，说明有溶血，不可再使用。

　　3.4抗原液的配制

　　①先做血凝试验测定效价，以抗原与红细胞完全凝集的孔为1HUA抗原，配制4HUA抗原应往前推算两孔，即除以4后的值。

　　②每次做试验前，必须重新检测禽流感抗原的血凝效价，以免效价发生改变而导致抗原稀释倍数不准确，从而导致试验结果不准确。

　　③为保证配制的抗原准确，还要进行抗原回滴试验。具体方法：做二排抗原回滴，在两排的第1~8孔各加25微升PBS，取4HAU抗原25微升加在两排的第1、第2孔，混匀，从第2孔倍比稀释至第4孔，弃去25微升，另一排同样。从第2至第8孔补25微升PBS，以保持75微升总量不变，另一排同样。两排的第1至第8孔各加25微升1%红细胞，震荡10秒钟。静置30分钟观察结果。这样在第1孔为4HAU抗原，第2孔为2HAU抗原，第3孔为1HAU抗原，第4孔为1/2HAU抗原，均为75微升总量，第5至第8孔为空白对照。如果抗原回滴试验不成立，应相应调整抗原浓度直至回招商词滴试验成立。因为如果抗原浓度过高，则所测定的抗体效价水平偏低，如果抗原浓度过低，则所测定的效价偏高。所以不调整抗原浓度至实验成立的话会对结果有很大影响。

　　4结果的判定

　　每次试验必须设阳性及阴性（空白）对照血清，判别试验是否成立。判读结果时，将酶标板倾斜45°，以孔底沉淀的红细胞流动性好，呈泪珠样流淌，边缘无凝集颗粒为凝集完全抑制。

　　5试验器具的清洗

　　每次试验完毕后，应将酶标板中液体甩净，然后用自来水反复冲净每个孔，再放入3%NaOH中4小时，清水反复冲净，再放入3%Hcl中4小时，清水反复冲净，再用蒸馏水反复冲洗几次，甩干水份，入干燥箱中干燥备用。实验用烧杯、加样槽、量筒等也应充分洗净、干燥。以免器具内有杂物、污物以及残留物从而影响试验结果。

　　四、小结

　　在进行禽流感血凝抑制试验时，应充分考虑到各方面的影响因素，提供的检测结果才会真实可靠，准确掌握禽类的免疫抗体水平，进而为科学防控禽流感提供理论依据。

　　血凝实验操作报告 篇2

　　一、原理

　　流感病毒颗粒表面的血凝素（HA）蛋白，具有识别并吸附于红细胞表面受体的结构，HA试验由此得名。HA蛋白的抗体与受体的特异性结合能够干扰HA蛋白与红细胞受体的结合从而出现抑制现象。

　　二、应用

　　该试验是目前WHO进行全球流感监测所普遍采用的试验方法。可用于流感病毒分离株HA亚型的'鉴定，也可用来检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体。

　　三、缺点

　　只有当抗原和抗体HA亚型相一致时才能出现HI现象，各亚型间无明显交叉反应；除鸡血清以外，用鸡红细胞检测哺乳动物和水禽的血清时需要除去存在于血清中的非特异凝集素；需要在每次试验时进行抗原标准化；需要正确判读的技能。

　　四、试验步骤

　　1 阿氏（Alvers）液配制

　　称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100mL，散热溶解后调pH值至6.1，

　　69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。（3.8%枸橼酸钠（3.8g枸橼酸钠，100ml超纯水），101 kPa,20min高压灭菌，4℃保存备用,保存期1个月）。

　　2 10%和1%鸡红细胞液的制备

　　2.1采血

　　用注射器吸取阿氏液约1mL（3.8%枸橼酸钠），取至少2只SPF鸡（如果没有SPF鸡，可用常规试验证明体内无禽流感和新城疫抗体的鸡），采血约2～4mL，与阿氏液混合（3.8%枸橼酸钠），放入装10mL阿氏液（生理盐水）的离心管中混匀。

　　2.2 洗涤鸡红细胞

　　将离心管中的血液经1500～1800 r/min 离心8分钟，弃上清液，沉淀物加入阿氏液（生理盐水），轻轻混合，再经1500～1800 r/min离心8分钟，用吸管移去上清液及沉淀红细胞上层的白细胞薄膜，再重复2次以上过程后，加入阿氏液20 mL（生理盐水），轻轻混合成红细胞悬液，4℃保存备用，不超过5天。

　　2.3 10%鸡红细胞悬液

　　取阿氏液保存不超过5天的红细胞，在锥形刻度离心管中离心1500～1800 r/min 8分钟，弃去上清液，准确观察刻度离心管中红细胞体积(mL)，加入9倍体积(mL)的生理盐水，用吸管反复吹吸使生理盐水与红细胞混合均匀。（此步

　　可省略，直接配制1%红细胞）

　　2.4 1%鸡红细胞液

　　取混合均匀的10%鸡红细胞悬液1 mL，加入9 mL生理盐水，混合均匀即可。（根据检测血清的数量，估算一下需要的1%鸡红细胞量，可按0.3ml/每份血清）

　　3 抗原血凝效价测定（HA试验，微量法）

　　3.1 在微量反应板的1孔～12孔均加入25μl PBS（生理盐水），换滴头。

　　3.2吸取25μl抗原加入第l孔，混匀。

　　3.3从第1孔吸取25μl，病毒液加入第2孔，混匀后吸取25μl加入第3孔，如此进行倍比稀释至第11孔，从第11孔吸取25μl弃之，换滴头。

　　3.4每孔再加入25μl PBS（生理盐水）。

　　3.5每孔均加入25μl 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

　　3.6振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1小时）。对照孔红细胞将呈明显的钮扣状沉到孔底。

　　3.7结果判定 将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见下表）。

　　表1：血凝试验结果判读标准

　　能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（-），否则此次检验无效。

　　4 血凝抑制（HI）试验（微量法）

　　4.1 根据3的试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1:256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1:64（256除以4）。

　　4.2 在微量反应板的1孔～11孔加入25μl PBS（生理盐水），第12孔加入50μl PBS（生理盐水）。

　　4.3 吸取25μl血清加入第1孔内，充分混匀后吸25μl于第2孔，依次倍比稀释至第10孔，从第10孔吸取25μl弃去。

　　4.4 1孔～11孔均加入含4HAU抗原25μl，室温（约20℃）静置至少30min。

　　4.5 每孔加入25μl 1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件

　　下进行），对照红细胞将呈现钮扣状沉于孔底。

　　4.6 结果判定

　　试验成立的条件：只有阴性对照孔血清滴度不大于21og2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。

　　以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

　　HI价小于或等于31og2判定HI试验阴性；HI价大于或等于41og2为阳性。

　　五、HI试验注意事项

　　1、合理选择抗原和对照阳性血清。针对Re-4和Re-5株疫苗免疫采用相应抗原和对照阳性血清。

　　同一亚型的禽流感病毒制成的抗原，如果毒株来源不同，则可能会存在抗原性差异，从而使检测同一血清的结果有差别。一般来讲，疫苗种毒株如果与抗原所用毒株相同时，则所测得的HI效价较高。

　　2、合理使用和保存抗原。反应试剂要按规定保存和使用，冻干的试剂应按照说明中规定的体积重新溶解并保存。要避免杂菌污染，因为污染所造成的非流感起源的凝集素也可与所有抗血清发生非特异反应。为避免反复冻融和细菌污染，可以无菌操作将试剂分装成小包装。

　　3、反应温度不能太高。若在37℃ （如温箱）下进行。