常见限制性酶切位点x

常见限制性内切酶识别序列(酶切位点)(BamHI、EcoRI、Hindlll、NdeI、XhoI等)分子生物学实验室技术2009-11-1717:46:32阅读2235评论2字号:大中小订阅.
在分子克隆实验中,限制性内切酶是必不可少的工具酶.
无论是构建克隆载体还是表达载体,要根据载体选择合适的内切酶(当然,使用T载就不必考虑了)。先将引物设计好,然后添加酶切识别序列到引物5'端(英语怎么说?)。常用的内切酶比如BamHI、EcoRI、Hindlll、NdeI、XhoI等可能你都已经记住了它们的识别序列,不过为了保险起见,还是得查证一下。
下面,我就总结了一些常用的内切酶的识别序列,仅供各位参考。下面这些内切酶都属于II型内切酶。
先介绍一下什么是II型内切酶吧。
TheTypeIIrestrictionsystemstypicallycontainindividualrestrictionenzymesandmodificationenzymencodedbyparategenes.TheTypeIIrestrictionenzymestypicallyrecognizespecificDNAquencesandcleaveatconstantpositionsatorclotothatquencetoproduce5-phosphatesand3-hydroxyls.UsuallytheyrequireMg2+ionsasacofactor,althoughsomehavemoreexoticrequirements.Themethyltransferasusuallyrecognizethesamequencealthoughsomearemorepromiscuous.ThreetypesofDNAmethyltransferashavebeenfoundaspartofTypeIIR-MsystemsformingeitherC5-methylcytosine,N4-methylcytosineorN6-methyladenine.
ApaI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GGGCCAC3'
BamHI
类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GAGATCC3'
BglII
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'AAGATCT3'
EcoRI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GAAATTC3'
HindIII
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'AAAGCTT3'
KpnI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GGTACAC3'
NcoI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'CACATGG3'
NdeI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'CAATATG3'
NheI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GACTAGC3'
NotI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列
5'GCAGGCCGC3'
SacI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GAGCTAC3'
SalI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GATCGAC3'
SphI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'GCATGAC3'
XbaI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'TACTAGA3'
XhoI
(类型:TypeIIrestrictionenzyme
)
识别序列:
5'CATCGAG3'
当然,上面总结的这些肯定不全,要查找更多内切酶的识别序列,你还可以选择下面几种方法:
查你所使用的内切酶的公司的目录或者网站;NEB网站上提供的识别序列图表下载
用软件如:PrimerPremier5.0或Bioedit等,这些软件均提供了内切酶识别序列的信息;
推荐到NEB的REBASE数据库去查(网址:reba.neb.com/reba/reba.html)当你设计好引物,添加上了内切酶识别序列,下一步或许是添加保护碱基了,可以参考:
NEB公司网站提供的保护碱基参考表下载
NEB公司网站上关于设计PCR引物保护碱基的参考
双酶切buffer的选择(MBI、罗氏、NEB、Promega、Takara)
这里再给大家推荐一种新的不需要连接反应的分子克隆方法,优点包括:
设计引物不必考虑选择什么酶切位点;
不必考虑保护碱基的问题;
不必每次都选择合适的酶来酶切质粒制备载体;
而且不需要DNA连接酶;
假阳性几率低(因为没有连接反应这一步,载体自连的问题没有了)
另外,还有一个经济问题:如果一次性制备一批载体(小提一次质粒约80UL),并将之线性化(可双酶切亦可单酶切),然后每次做分子克隆实验时用一点,大约可以做约40次转化,管上一年没问题,呵呵。